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       【摘要】 
       目的观察铁甲草醇提取物抑制二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化形成的作用效果并探讨其作用机制。方法采用二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化模型，用高、中、低剂量(12.6，4.2，1.4 g/kg)的铁甲草醇提液进行干预治疗，并与秋水仙碱进行对照，检测大鼠肝功能、血清透明质酸(HA)、层粘蛋白（LN）和Ⅲ型前胶原氨基端肽(PCⅢ)、 肝组织羟脯胺酸(Hyp)含量及肝脏病理组织学改变。 结果铁甲草高、中、低剂量组血清谷丙转氨酶(ALT)及铁甲草高剂量组血清谷草转氨酶(AST)水平与模型组比较有统计学意义(P <0.05)；铁甲草各剂量组大鼠肝组织Hyp含量均明显低于模型组(P <0.05)。铁甲草各剂量组大鼠血清HA 、LN、 PCⅢ含量明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。铁甲草高、中、低剂量组肝组织纤维化病变明显减轻，与模型组比较，差异有统计学意义(P <0.05)。 结论铁甲草对二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化形成具有明显的抑制作用，其机制可能与保护肝细胞和抑制胶原纤维合成有关。
       【关键词】  铁甲草； 肝纤维化； 二甲基亚硝胺
       Inhibitive Effects of Extract of Cassia mimosoides Linn on Dimethylnitrosamine-induced Hepatic Fobrosis in Rats
       ZHANG Jida,WEN Chengping,FAN Yongsheng
       （Zhejiang University of Chinese Medicine,Hangzhou 310053,China）
       Abstract：ObjectiveThe aim of this study was to observe the inhibitive effects of the extract of Cassia mimosoides Linn. on dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis in rats and to explore the action mechanism. MethodsIntervention treatment with the extract of Cassia mimosoides Linn. was explored in the rats with dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis at the high, intermediate, and low doses of 12.6 g/kg，4.2 g/kg，and 1.4 g/kg respectively, compared with the group treated with colchicine. Hepatic function, levels of serum hyaluronic acid (HA), serum laminin (LN), serum aminoterminal propeptide of type III procollagen (PIIINP), hepatic hydroxyproline (Hyp) in rats were assayed and histopathological alterations in rats were examined. ResultsThe results indicated that, compared with those in the model group, alterations in the levels of serum alanine aminotransferase (ALT) in the groups treated with extract of Cassia mimosoides at low, intermediate, and high doses, and serum aspartate aminotransferase (AST) level in the group at the high dose were statistically significant (P<0.05); hepatic hydroxyproline (Hyp) levels in the rats treated with extract of Cassia mimosoides at various doses were significantly lower than those in the model group (P<0.05). Levels of serum hyaluronic acid (HA), serum laminin (LN), and serum aminoterminal propeptide of type III procollagen (PIIINP) in the groups treated with extract of Cassia mimosoides were significantly lower than those in the model group, and the differences were statistically significant (P<0.05). Hepatic fibrosis of rats in the groups treated with extract of Cassia mimosoides at high, intermediate, and low doses alleviated significantly, and the differences compared with the pathological changes in the model group were statistically significant. ConclusionIt was concluded that, intragastric administration with extract of Cassia mimosoides showed significant inhibitive effects on the dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis in rats, and the inhibitive mechanisms might be related with the protective effects on hepatic cells and the inhibition on collagen fiber synthesis.      
       Key words：Cassia mimosoides Linn. (Leguminosae);   Hepatic fibrosis;   Dimethylnitrosamine
       
       铁甲草Cassia mimosoides Linn.为豆科（Leguminosae）决明属植物，味甘、微苦，性凉，归肝、肾和肺经；具有清肝明目、利水通淋和解毒消痈功能；可用于治疗湿热黄疸、头昏眼花、水肿和痈肿疔疮等［1］。文献报道铁甲草含有大黄素、木犀草素-7-葡萄苷、大黄素甲醚、大黄酸［2，3］、1,8-dihydroxy-6-methoxy-2-methyl -anthraquinone［4］。铁甲草在广东梅州地区民间主要用于慢性乙型肝炎和肝纤维化的治疗，为探讨铁甲草对实验性肝纤维化形成的抑制作用，我们以SD大鼠为实验对象，对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型进行干预治疗，观察药物的作用效果并探讨其作用机制。
       1   材料与仪器
       1.1  动物
       SPF级SD雄性大鼠，60只，体重160～180g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号： 2007A003；在广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室饲养，动物实验设施证明：0022793。大鼠饲料由广东省医学实验动物中心提供。
       1.2  药物铁甲草全草2007-10购于广东省梅州市蕉岭县，用85％乙醇提取3次，混合后浓缩成含生药材1.26 g/ml，用时以蒸馏水配成所需浓度。
        
       秋水仙碱：西双版纳版纳药业有限责任公司，规格：0.5 mg/片，批号：20071108，用时以生理盐水溶解。
       1.3  试剂二甲基亚硝胺(DMN)：购于天津化学试剂研究所，批号：060523,使用前用生理盐水配成0.5%溶液备用；天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHOL）试剂盒，由中生北控生物科技股份有限公司生产；透明质酸(HA) 、层粘蛋白（LN）和Ⅲ型前胶原氨基端肽(PCⅢ)试剂盒,由北京北方生物技术研究所生产，批号：080220；总蛋白（TP）和白蛋白(AlB)测试试剂自配。
       1.4  仪器AU5421全自动生化检测仪(奥林巴斯公司)；FJ-2008PS全自动γ免疫计数器(西安核仪器厂)；KDC02042 低温冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；TU-1001型紫外可见分光光度计 (上海紧密仪器仪表有限公司)；OlympusCK40一F200倒置显微镜（日本 Olympusoptical公司）。
       2  方法
       2.1  动物分组及造模给药 60只SD雄性大鼠，随机分为6组，每组10只，分别为正常组，模型组，铁甲草醇提取高剂量组、中剂量组和低剂量组(12.6，4.2，1.4 g/kg)，秋水仙碱治疗组(0.2 mg/kg)。除正常组外，其余各组动物均进行肝纤维化模型制备［5］，以0.5％DMN溶液(1∶199生理盐水稀释)按体重10 mg/kg剂量腹腔注射，每周连续3 d，1次/d，第1周每次用2/3剂量，以后用全量，共4周，正常组用等体积的生理盐水。在制备模型的同时，铁甲草高、中、低剂量组和秋水仙碱治疗组均灌胃给药，1次/d，共4周，正常组和模型组均予等量生理盐水灌胃。第4周末处死动物，摘眼球取血，分离血清，待检；取肝左叶组织，一部分制成匀浆待检，一部分用10％甲醛溶液固定，送检。
       2.2  血清肝功能及肝纤维化指标检测  采用全自动生化仪检测血清肝功能，放免法检测血清肝纤维化指标。
       2.3  肝组织Hyp测定 采用碱水解法检测肝组织Hyp，按试剂盒说明操作。
       2.4  病理组织学观察  10％甲醛溶液固定肝组织，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察拍照。肝组织纤维化病变按严重程度分为5期(S0～4)［6］：①S0：无纤维化病变；②Sl：汇管区、汇管区周围纤维化，局限窦周或小叶内纤维化，不影响小叶结构的完整性；③S2：汇管区周围纤维化，纤维间隔形成，但小叶结构大部仍保留；④S3：大量纤维间隔，分隔并破坏肝小叶，致小叶结构紊乱，但尚无肝硬化；⑤S4：早期肝硬化，肝实质广泛破坏，弥漫性纤维增生，被分隔的肝细胞团呈不同程度的再生及假小叶形成。
       2.5  统计学方法 采用SPSS11．5软件包进行统计分析，多组计量资料分析采用One way ANOVA，多重比较采用LSD。等级分组资料采用Ridit检验。
       3  结果
       3.1  大鼠死亡情况 全部实验结束后，正常组无大鼠死亡，模型组、秋水仙碱组及醇提取低剂量组各组死亡2只， 醇提取中、高剂量组各死亡1只。
       3.2  铁甲草对肝纤维化大鼠肝功能的影响 结果见表1。表1  铁甲草对肝纤维化大鼠血清ALT和AST的影响（略）
        
       从表1可以看出，造模及给药4周后，模型组和其他治疗组大鼠血清的ALT、AST的活性明显升高，且与正常对照组比较差别有统计学意义（P<0.01）。
        
       与模型组比较，铁甲草醇提取各剂量组大鼠血清的ALT下降，与模型组差别有统计学意义（P<0.05或P<0.01），而只有醇提取高剂量组大鼠血清的AST与模型组比较差别有统计学意义（P<0.05）。
        
       与秋水仙碱组比较，铁甲草醇提取高剂量组大鼠血清的AST与秋水仙碱组比较差别有统计学意义（P<0.05），提示铁甲草醇提取高剂量组对二甲基亚硝胺所致的AST升高有明显的降低作用，且作用优于秋水仙碱组。
       
       从表2可以看出，造模及给药4周后，各组大鼠血清的TP、ALB及GLO下降明显，且与正常组比较差别有统计学意义（P<0.01），提示肝纤维化造模比较理想。表2  铁甲草对肝纤维化大鼠血清TP、ALB和GLO影响（略）
        
       铁甲草醇提取高、中剂量组大鼠血清TP及ALB含量与秋水仙碱组相当，且与模型组比较差别有统计学意义（P<0.05），提示在造模同时给予铁甲草，铁甲草醇提取高、中剂量对二甲基亚硝胺所致的大鼠肝脏有保护作用。
       3.3  铁甲草对肝纤维化大鼠CHOL、TG和肝组织Hyp含量的影响 结果见表3。表3  铁甲草对肝纤维化大鼠CHOL、TG和Hyp的影响（略）
        
       从表3可以看出，造模及给药4周后，各组大鼠血清的CHOL和Hyp明显升高。醇提取高剂量组大鼠血清中的CHOL与正常组比较差别有统计学意义（P<0.05），其余组与正常组差别无统计学意义。各组大鼠血清中的TG均低于正常组（P<0.01或P<0.05）。
        
       使用二甲基亚硝胺造模后，各组大鼠肝脏组织的Hyp明显升高，与正常比较差别有统计学意义（P<0.01）；同时给予铁甲草治疗，铁甲草醇提取各剂量组大鼠肝脏组织Hyp含量明显低于模型组，与模型组比较差别有统计学意义(P<0.05），提示醇提取各剂量组对大鼠肝纤维化有一定效果，且其作用与秋水仙碱相当。
       3.4  铁甲草对肝纤维化大鼠HA、LN和PCⅢ的影响结果见表4。
        
       从表4可以看出，造模及给药4周后，各组大鼠血清HA、LN和PCⅢ升高明显，与正常组比较差别有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。表4  铁甲草对肝纤维化大鼠血清HA、LN和PCⅢ的影响（略）
        
       铁甲草醇提取各剂量组大鼠血清的HA、LN与PCⅢ下降趋势明显，与模型组比较差别有统计学意义（P<0.05），显示醇提取各剂量组对HA、LN的升高有明显的抑制作用，且与秋水仙碱相当。
       3.5   病理组织学观察 肝组织HE染色显示：正常组大鼠肝细胞束排列整齐，呈单行放射状排列在中央静脉周围，无肝细胞变性、坏死和纤维增生改变，肝窦无扩张出血；模型组大鼠肝索排列紊乱，肝细胞空泡变性，可见大片肝细胞出血性坏死，在门脉区有大量的结缔组织增生，胶原纤维增生明显，有宽大的纤维间隔，向小叶内伸展，形成假小叶，大部分大鼠肝小叶结构破坏，有少量的炎性细胞浸润；铁甲草醇提取高、中、低剂量组肝细胞变性坏死较模型组明显减轻，肝组织内结缔组织增生程度明显减轻。统计结果显示，铁甲草高、中、低剂量组肝组织纤维化病变明显减轻，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表5。表5  铁甲草对实验大鼠肝纤维化的影响（略）
       4  讨论
           
       二甲基亚硝胺诱导每周连续3 d腹腔注射，共3～4周的方法是化学中毒诱导大鼠肝纤维化的经典造模方法，具有模型肝组织纤维间隔明显，并且在染毒停止后不易消退等特点，在肝纤维化的研究中有着广泛应用［7］。本研究结果显示DMN诱导的大鼠肝纤维化模型有明显的慢性肝损伤和肝纤维化表现。运用铁甲草醇提取液干预治疗，结果显示各剂量对肝功能指标AST、ALT有不同程度的改善，表明该药有较好的护肝降酶作用。各剂量组的Hyp水平降低，HA、LN与PCⅢ下降趋势明显，且能在病理形态学上减轻肝组织纤维化的病变程度，表明其有抑制胶原的合成，具有抗肝纤维化的作用。
       【参考文献】
         　［1］宋立人,洪 恂，丁绪亮，等. 现代中药大辞典［M］.北京:人民卫生出版社,2001：184.
       
       ［2］Subramanian S S, Nagarajan S. Chemical examination of the leaves of Cassia mimosoides［J］. Indian J Pharm, 1969, 31 (4): 110.
       
       ［3］Subramanian S S, Nagarajan S. Chemical components of the roots and seeds of Cassia mimosoides［J］. Indian J Pharm,1970, 32 (3): 70.
       
       ［4］Mukherjee K S, Bhattacharjee P, Mukherjee R K, et al. A new anthraquinone pigment from Cassia mimosoides Linn［J］. J Indian Chem Soc, 1987, 64 (2): 130.
       
       ［5］Ala-Kokko L，Pihlajaniemi T，Myers J，et al. gene expression of type Ⅰ,Ⅲ and Ⅳ collagens in hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine in the rats［J］.Biochem J，1987，244：75.
       
       ［6］中华医学会传染病与寄生虫病学分会，肝病学分会联合修订.2000年9月西安 病毒性肝炎防治方案［J］. 中华肝脏病杂志，2002，8(6):324.
       
       ［7］陈文惠，刘 平，徐光富，等. 脂质过氧化在二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化形成中的作用［J］. 世界华人消化杂志，2001，9（6）：645.