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       【摘要】 
       目的建立恰麻古儿多糖的最佳提取工艺并测定其含量。方法采用正交实验法L9(34)筛选提取条件，用硫酸-蒽酮法对其含量进行测定。结果恰麻古儿中多糖的平均含量为11.53%,平均回收率为99.82%,RSD为2.53%。结论优选得到的工艺经济，简单，稳定，可行，该法可作为恰麻古儿中多糖的含量测定方法。
       【关键词】  恰麻儿古； 多糖； 正交
       Research on Polysaccharide Extraction and the Content of Brassica rapa L.
       HOU Baolin,WANG Xi,Hai lixi·taoerdahong*
       （Xinjiang Medical University,Xinjiang 830054,China）
       Abstract：ObjectiveTo establish the optimum procedure of the polysaccharide extraction　of Brassicarapa L. and determine the content of polysaccharide. MethodsUsing orthogonal design L9(34) to choose the best condition.The content of polysaccharide was determined by the anthrone-H2SO4 colorimetric method. ResultsThe average content of poysaccharide in Brassica rapa L. was 11.53%.The average recovery rate was 99.82% with 2.53% of RSD(n=5). ConclusionThe optimized procedure is economical,simple,stable and efficient.The method of the polysaccharide of Brassicarapa L. is appropriate.
       Key words： Brassica rapa L.;   Polysaccharide;  Orthogonal determination
       
       维药恰麻古儿Brassica rapa L.十字花科芸蔓种芜菁亚种，地下茎入药。维族传统的药食兼用植物，具有开胸顺气，健胃消食，解毒等功效。研究发现恰麻古儿具有抗衰老［1］，延长果蝇的寿命，抗辐射等功效。多糖是许多植物药的有效成分［2］，是一类免疫活性物质有提高免疫能力作用［3］。目前,对多糖的研究越来越全面、深入,不断有新型生物多糖被发现。关于恰麻古儿多糖现未见文献报道，本文采用正交实验法筛选了多糖提取的最佳条件并进行含量测定,为恰麻古儿多糖在食品和保健品中的深度开发利用提供理论依据。
       1  仪器与试剂 
          
       721型分光光度计(上海分析仪器厂)，冷冻干燥机，高速粉碎机(浙江五金药具厂)；无水乙醇，丙酮，乙醚，蒽酮，硫酸，氯仿，正丁醇，石油醚，葡萄糖均为分析纯，恰麻古儿购于阿克苏柯坪。
       2   方法与结果
       2.1  多糖提取工艺流程与精制
       取干燥的恰麻古儿50 g粉碎→石油醚回流(3次,2 h/次)→药渣挥干，80%乙醇回流(3次,2 h/次)→药渣挥干，蒸馏水回流(3次,2 h/次)提取液(过滤)→合并滤液浓缩至50 ml→Sevag法(氯仿∶正丁醇 =5∶1)除蛋白质→活性碳60℃保温30 min脱色(抽滤)→滤液(乙醇沉淀)→沉淀用无水乙醇，丙酮，乙醚反复冲洗→冷冻干燥，精制多糖，密封保存备用。
       2.2  葡萄糖标准溶液的配置 
       精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.200 0 g，置100 ml容量瓶中,加蒸馏水溶解并稀释至刻度;摇匀,制成2.000 mg/ml的标准贮备液。然后分别取5支试管,各取0.20，0.40，0.60，0.80，1.0 ml上述贮备液稀释至10 ml，配成系列标准溶液。
       2.3  波长的选择 
       分别精确吸取1 ml葡萄糖对照品溶液和供试品溶液于具塞试管中，各加入5 ml蒽酮试剂(精密称取0.200 0 g蒽酮，加入100 ml浓硫酸,置于棕色瓶中,摇匀置暗处，现配现用),立即摇匀置冰水浴中，沸水浴中加热15 min，取出流水冷却，室温静置10 min。另以未加葡萄糖的溶液为空白液，于400～700 nm波长范围内扫描，测得对照品和样品的最大吸收波长均为625 nm。
       2.4  标准曲线的绘制 
       移取已配制好的系列标准溶液于具塞试管中(各平行3份)以1 ml蒸馏水作空白，各加入5 ml蒽酮试剂(立即摇匀,置冰水浴中)，加完后一起沸水浴15 min［4］，流水冷却，室温静置10 min，于625 nm处测定吸光值，以吸光值(A)对葡萄糖浓度(C)作回归处理，得回归方程A=4.602 5C-0.009 3，r=0.999 8。在40～200 μg范围内呈良好线性关系。
       2.5  换算因子的测定
       精密称取干燥至恒重的精制多糖10 mg，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取此液1.0 ml置10ml容量瓶中,蒸馏水定容，摇匀作贮备液。精密吸取贮备液2.0 ml，用标准曲线项的方法测吸光值，从回归方程中求出多糖供试液中葡萄糖浓度，按下式计算，测得换算因子F=2.24。换算因子f=W/(c×d)。［W为多糖含量(mg),c为多糖稀释液中葡萄糖浓度(mg/ml),d为多糖的稀释因素］。
       2.6  单因素实验分别选取对提取多糖有重要影响的因素
       温度为70，80，90，100℃ 4个水平，料液比为1∶20，1∶30，1∶40，1∶50等4个水平，时间为1，2，3，4 h等4个水平，提取次数1，2，3，4次4个水平进行实验。
       2.6.1  提取温度对多糖得率的影响
        
       料液比1∶30，提取时间2 h，提取次数3次条件下考察温度对多糖得率的影响。图1表明在60～100℃范围内，随着温度的提高，多糖得率逐渐增大，考虑防止多糖高温降解，故采用90℃进行提取。
       2.6.2  提取时间对多糖得率的影响
       温度90℃，料液比1∶30，提取次数3次条件下考察提取时间对多糖得率的影响。图2 中可以看出，多糖得率随着时间增加而增大，2 h 后随着时间的延长而增长缓慢，所以2h的提取时间较合适。
       2.6.3  料液比对多糖得率的影响
       温度90℃，时间2 h，次数为3次，考察料液比对多糖得率的影响。图3可以看出多糖得率在料液比为1∶30时达到最大，随着用水量增加，得率有所提高，但不利于后期的分离浓缩，故1∶30料液比为宜。
       2.6.4  提取次数对多糖得率的影响 
       温度90℃,料液比1∶30，提取时间2 h，考察提取次数对多糖得率的影响。图4可以看出，随着浸提次数的提高，多糖浸提率也随着不断提高。在第4次提取看出提取率变化不明显，故最佳提取次数定在3次。
       2.7  正交实验  
       正交实验法筛选了恰麻古儿多糖提取最优条件，以提取所得多糖含量为指标,对温度、料液比、提取时间，提取次数4个因素,选用L9(34)因素水平进行了选择［5］,各因素水平见表1。由表2～3得知影响新疆恰麻古儿多糖提取因素大小是: A＞C＞D＞B，A2B1C2D3为最优组合即提取温度为90℃，提取时间为2 h，料液比1∶30(g/ml) 提取次数为3次，故本文后续多糖提取均按此进行。表1  因素水平（略）表2  正交实验方案与结果（略）
       表3  方差分析（略）
       2.8  恰麻古儿多糖的含量测定 
       精密称取恰麻古儿粉末0.5g加入80%乙醇40 ml，回流提取(3次,2 h/次)，趁热抽滤，残渣用乙醇洗涤，残渣连同滤纸置圆底烧瓶中。按照正交得出的最优提取条件提取，趁热抽滤，残渣用热水洗涤，洗液并入滤液中，置冷后，定容于100 ml量瓶中，再取5ml定容于25 ml量瓶中，摇匀备用。精密吸取样品溶液2.0 ml，同“2.4”项下方法操作。按下式计算多糖含量:多糖（%）=CDF/W
       
       C为样品溶液中葡萄糖浓度(mg/ml)，D为样品溶液稀释因素，F为换算因子，W为样品重量(mg)。结果见表4。表4  方差分析（略）
       2.9  精密度实验精密称取阿克苏产地恰麻古儿粉末0.5g（5份），同“2.8”方法操作。计算多糖含量。结果平均含量11.504%，RSD为3.82%。
       2.10  稳定性实验精密吸取“2.8”项中样品溶液2.0 ml(3份),在0～8 h内，每隔2 h按“2.4”项下方法测定吸光度，计算多糖含量。结果平均含量11.45%，RSD为2.93%。结果表明溶液在8 h内稳定。
       2.11  回收率的测定精密称取阿克苏恰麻古儿粉末0.5g（3份），各加入精制多糖20 mg，同“2.4”项下方法操作。计算多糖含量。结果平均回收率99.82%，RSD为2.53%。
       3  讨论
          
       本实验首次采用正交实验法对恰麻古儿多糖提取条件进行研究，并用蒽酮-硫酸法测定其含量。测定结果显示恰麻古儿的水溶液中含有丰富的多糖。由于多糖的生物活性与其纯度和化学结构即糖苷键的不同连接方式有着重要的关系，因此，对恰麻古儿多糖的结构测定、活性测定及结构修饰等方面还需要进一步研究。
       【参考文献】
         　［1］马 龙，屈卫生，邓淑文，等.新疆芜菁抗衰老作用的实脸研究［J］.新疆医学院学报，1998，21(1):34.
       
       ［2］Tu F, Yang F, Zheng WJ, et al. Progress in polysaccharide of Spirulina［J］. Nat Prod Res Dev, 2005, 17:115.
       
       ［3］中国科学院上海药物研究所.中草药有效成分提取与分离［M］.上海:上海科学技术出版社,1983：7.
       
       ［4］徐伟,郑海音,郑晓燕,等.石见穿多糖的含量测定及组分分析［J］.福建中医学院学报,2008,18(1):20.
       
       ［5］刘定远,医药数理统计方法［M］.北京:人民卫生出版社,1999：254.