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       【摘要】 
       目的对比研究小柴胡汤超微饮片与常规饮片化学成分溶出量及溶出速度的变化，为中药复方超微饮片临床应用提供科学依据。方法 考察浸泡（或煎煮）时间、溶剂量对两种饮片化学成分溶出量的影响；分别采用紫外分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)测定两种饮片中总黄酮及黄芩苷的含量。结果在相同条件下，超微饮片水溶性成分、总黄酮及黄芩苷溶出量均明显高于常规饮片（P<0.01）；总黄酮及黄芩苷的溶出速度加快（P<0.05）。结论小柴胡汤经超微粉碎后，其水溶性成分、总黄酮及黄芩苷的溶出量显著提高，有效成分溶出速度增加。
       【关键词】  小柴胡汤； 超微饮片； 总黄酮； 黄芩苷
       在中医临床上，中药常规饮片是组成中药复方汤剂的常用饮片之一,为医生的辨证论治提供了方便的中药及剂量变换方式，但由于汤剂的使用量较大，患者需要花费一定的时间煎煮药材，造成药材资源、能源及时间的极大浪费。近年来,迅速发展起来的超微粉碎技术已用于中药饮片的加工，可将常规饮片进行微米级超细化，破碎细胞壁，比表面积增大,使药物成分的释放速度和释放量大大增加［1～3］。有关单味中药的超微饮片化学成分溶出度方面的研究已有很多报道，但中药复方超微饮片的研究相对较少。本项研究探讨张仲景名方小柴胡汤超微饮片与常规饮片水溶性成分、总黄酮溶出量及指标成分黄芩苷含量及溶出速度的变化,旨在为中药超微饮片临床应用提供科学依据。
       1  材料与仪器
       1.1  药品及试剂 
       小柴胡汤 (柴胡24 g，黄芩9 g，党参9 g，大枣9 g，半夏9 g，甘草9 g，生姜9 g) 超微饮片和小柴胡汤常规饮片均由广东九天绿药业有限公司提供（批号20080901）；黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号110715-200815)；高效液相用甲醇为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；薄层层析硅胶G（青岛海洋化工有限公司）；其它试剂均为国产分析纯，购自广州化学试剂公司；高纯水为本实验室自制。
       1.2 仪器 
        
       UltiMate-3000型高效液相色谱仪（美国戴安公司）； UV－2401PC分光光度仪（日本岛津公司）； GL-10M高速冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；HHS-4S型电子恒温不锈钢水浴锅（上海市南阳科学仪器厂）；766-1型远红外辐射干燥箱（南阳科学仪器厂）；CP225D型电子天平（德国SARTORIUS AGGOTTINGEN公司）；Nikon Eclipse E600生物显微镜（日本尼康公司）；Nikon Coolpix 4500数码相机（日本尼康公司）。
       2 方法
       2.1 小柴胡汤供试样品的制备  
       按处方比例分别称取小柴胡汤超微饮片及常规饮片39 g，分别加药材总量5，10，20倍溶剂水（90℃以上蒸馏水），超微饮片置100℃的水浴锅中浸泡2次、常规饮片回流提取2次，30 min/次，离心（5 000 r/min,10 min,25℃）次，取上清液浓缩定容至250 ml（0.156 g·ml-1），备用。
       2.2 小柴胡汤超微饮片粒度检测 
       取小柴胡汤超微饮片待检样品少许，制成临时水装片，显微镜下观察，计算样品细胞破壁率。
       2.3  小柴胡汤两种饮片黄芩苷薄层色谱鉴别
       小柴胡汤超微饮片样品、常规饮片样品、阴性样品及对照品试液均按《中国药典》“小柴胡颗粒”“鉴别”项下方法制备。
       2.4  水溶性浸出物测定 　
       按照水溶性浸出物测定法项下的热浸法（《中国药典》2005年版附录XA)测定。
       
       2.5  小柴胡汤两种饮片总黄酮溶出量及溶出速度测定
       2.5.1  样品供试液制备  
       ①精密移取“2.1”项下制备样品各50 ml，浓缩至15 ml，加95％乙醇35 ml醇沉，静置过夜。次日抽滤，滤液加70%乙醇定容至50 ml。②取上述试液各1.0 ml移于蒸发皿中水浴挥干，50％甲醇溶解，定容至100 ml作为供试液。
       2.5.2  标准曲线制作 
       精密称取黄芩苷标准品6.60mg，50％甲醇溶解定容至10 ml。分别吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 ml加50%甲醇定容至10 ml作为标准品试液。以277 nm作为检测波长测其吸收值（Abs），以浓度为横坐标(X), Abs为纵坐标（Y）得回归方程Y=58.4X+0.006 5，r2=0.999 9,线性范围0.006 6～0.033 0 mg· ml-1。
       2.5.3  总黄酮溶出量测定
       以50％甲醇溶液作为空白对照调整基线，取“2.5.1”项各供试液在277nm处测定吸收值，根据标准曲线计算小柴胡汤两种饮片每克药材总黄酮含量（mg·g-1）。
       2.5.4  总黄酮溶出速度比较 
       根据上述实验结果，在本实验设计的条件下，在20倍加水量时总黄酮溶出最大，所以我们采用20倍溶剂条件，分别考察不同时间条件下，两种饮片每克药材中总黄酮的溶出量（mg·g-1）。
       2.6  小柴胡汤两种饮片黄芩苷溶出量及溶出速度测定
       2.6.1  色谱条件 
       C18 Kromasil柱，4.6 mm×250 mm；以甲醇-水-磷酸(V:V:V,47∶53∶0.2)为流动相；检测波长315nm［4］；进样量10 μl；流速1.0 ml·min-1；柱温25℃。
       2.6.2  样品供试液制备 
       量取“2.5.1”项①醇沉液1.0 ml，70％乙醇定容至10 ml作为样品供试液。
       2.6.3  标准曲线制作 
       精密称量7.10 mg黄芩苷标准品,甲醇溶解定容至10ml,分别量取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 ml加甲醇定容至10 ml作为标准品试液。在“2.6.1”色谱条件下测其峰面积；以浓度（mg·ml-1）为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)得标准曲线Y=429.42X-0.5652 r2=0.999 9，线性范围0.007 1～0.056 8 mg·ml-1。
       2.6.4  黄芩苷含量测定 
       据标准曲线计算小柴胡汤两种饮片每克药材中黄芩苷含量（mg·g-1）。
       2.6.5  黄芩苷溶出速度比较 
       采用20倍溶剂条件，分别考察不同时间条件下，两种饮片每克药材黄芩苷溶出量（mg·g-1）。
       2.7  统计分析方法
       采用SPSS 13.0软件处理，组间比较采用两样本t检验；组内比较采用单向方差分析。
       
       3  结果
       3.1 小柴胡汤超微饮片粒度检测 
       显微镜下可见样品绝大部分为颗粒状物质，主要为各类单复淀粉粒、晶体及其他细胞碎片，细胞破壁率占视野的90%以上，其直径为5～38 μm，一般的颗粒直径约25 μm，个别大的团块直径达100 μm。少数长杆状物质主要为导管、纤维的碎片，一般长度75～93 μm，个别长的达193 μm。除极个别石细胞、木纤维等可见完整细胞外，其余均无完整细胞形态。结果见图1～3。  
       3.2 小柴胡汤两种饮片黄芩苷薄层色谱鉴别 
       在黄芩苷对照品相同位置超微饮片、常规饮片均出现墨绿色斑点，阴性对照品相同位置未见斑点。结果见图4。
       3.3  水溶性浸出物测定 
       实验结果表明，在相同条件下，超微饮片的水溶性成分溶出量显著多于常规饮片（P<0.01，n=4）。超微饮片在最小加水量时（溶剂水∶药材量5∶1）水溶性浸出物大于常规饮片最大加水量组（溶剂水∶药材量20∶1）。结果见图5。
       3.4  总黄酮溶出量测定  在相同条件下，超微饮片总黄酮溶出量显著大于常规饮片（P<0.01,n=4），且随溶剂量的增大总黄酮溶出量增多。结果见图6。
       3.5  总黄酮溶出速度比较 
       实验结果表明，在20倍加水量条件下，超微饮片中总黄酮的溶出速度加快，与常规饮片比较有显著性差异，但超微饮片在不同的时间点比较无显著性差异（P>0.7），提示超微饮片有效成分在短时间内可快速溶出，而常规饮片总黄酮溶出量在60 min 时最多，与时间呈正相关。结果见表1。表1  超微饮片与常规饮片总黄酮溶出速度比较（略）
       3.6  黄芩苷溶出量测定 
       高效液相色谱实验结果表明，在相同条件下，黄芩苷溶出量超微饮片显著大于常规饮片（P<0.01,n=4）。结果见图7～8。
       
       3.7  黄芩苷溶出速度比较 
       在相同溶剂量，相同煎煮时间时，黄芩苷的溶出速度超微饮片明显快于常规饮片（P<0.01,n =4），在实验条件最短时间（10 min）与其它时间点比较，超微饮片组间比较黄芩苷溶出量无显著性差异（P>0.7），表明饮片中有效成分的溶出速度加快。在常规饮片中，黄芩苷溶出量与煎煮时间呈正相关。见表2。表2  超微饮片与常规饮片黄芩苷溶出速度比较（略）
       4 讨论
          
       中药超微饮片是随着超微粉体技术发展而兴起的中药饮片加工新技术。中药饮片经超微粉碎后细胞破碎但并不改变其药效作用的物质基础，可使细胞内的成分不经过细胞壁(膜) 而直接溶出, 从而使饮片中的药物成分溶解的更快更完全，随着药材的比表面积增加，化学溶出物增加，提高了生物利用度，这对减少药材的用量、保护中药材资源具有重要的意义。
       
       小柴胡汤出自汉代张仲景《伤寒论》，主要用于治疗伤寒少阳证和妇人热入血室证［5］。现代研究表明具有解热抗炎、抗病毒、免疫调节、保肝利胆、抗肿瘤等药理作用，临床应用十分广泛［6～8］。本实验仅以小柴胡汤为代表，比较了中药复方常规饮片与超微饮片化学成分溶出特性的变化。实验结果表明，在相同溶剂体积、相同煎煮（浸泡）时间条件下，小柴胡汤复方经超微粉碎后水溶性成分溶出量增加，药物的有效化学成分总黄酮及黄芩苷溶出量是传统饮片的2倍左右，同时其溶出量的时间上，超微饮片浸泡10 min与浸泡60 min 没有显著性差异，表明超微粉碎后，药材的细胞壁被破碎，比面积增大，溶出速度加快。传统饮片化学成分的溶出量随着煎煮时间的延长而增加。本实验从小柴胡汤的化学特性方面探讨超微饮片与常规饮片溶出量之间的关系，至于两者量效关系，尚待药效学进一步研究。
       【参考文献】
         　［1］丁志平,孙毅坤,乔延江.不同粒径黄连粉体中小檗碱体外溶出研究［J］.北京中医药大学学报,2004，27（3）：60.
       
       ［2］司 南，杨 健，边宝林. 不同粒度麻杏石甘汤配方药材超微粉中麻黄碱及伪麻黄碱的溶出率比较［J］.中国中药杂志,2006，31（11）:884.
       
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       ［4］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：358.
       
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       ［6］杨 媛.小柴胡汤的现代药理研究进展［J］.成都医药,2002,28(6):373.
       
       ［7］柒小梅,李 英,秦雪梅.小柴胡汤临床应用与药理作用研究进展［J］.山西中医学院学报,2007, 8 (3): 59.
       
       ［8］刘 川,钱兴澍. 近年研究小柴胡汤文献分析［J］. 成都中医药大学学报,2003，26（4）：45.