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       【摘要】 
       目的探讨负载肿瘤抗原DC诱导的CTLs对乳腺癌细胞的杀伤作用。方法以负载肿瘤细胞抗原的DCs体外诱导CTLs，用ELISA法检测IFN-γ和IL-12的表达水平，用LDH法检测CTL对乳腺癌细胞的杀伤作用。结果负载肿瘤抗原DC组IFN-γ和IL-12的浓度高于未致敏DC组、抗原组及单核细胞对照组(P＜0.05)，且负载抗原DC组所刺激的CTLs的杀伤作用也强于未致敏DC组、抗原组及单个核细胞组(P＜0.01)及对照的HT-29组(P＜0.01)。结论采用乳腺癌细胞冻融抗原体外致敏DC，诱导产生肿瘤抗原特异性CTLs具有显著的抑瘤效应，实验证明致敏DC治疗乳腺癌是一种有效的方法，有望成为乳腺癌免疫治疗的新疗法。
       【关键词】  乳腺癌； 树突状细胞； 细胞毒性T细胞
       乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女新发乳腺癌，占女性所有肿瘤的18%。乳腺癌总的5年生存率约50%～60%，近50%患者治疗后出现复发转移。晚期乳腺癌患者平均生存时间仅18～30个月。人们一直在努力发展新的治疗策略以降低乳腺癌的复发和转移，提高患者生活质量并尽可能延长乳腺癌患者的生存期［1］。生物治疗是近年来发展迅猛的又一重要治疗手段。目前的研究表明，树突状细胞（DC）激活的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）介导的免疫反应在机体抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用［2，3］。本研究应用冻融法获取乳腺癌细胞抗原致敏DC，观察其诱导的CTLs对乳腺癌细胞的杀伤作用，探讨DC疫苗用于乳腺癌患者免疫治疗的可行性。
       1  材料
           
       人乳腺癌细胞株MCF-7、人结肠癌细胞株HT-29购自中国医学科学院肿瘤医院。rh GM-CSF、rhIL-4、rh TNF-a为美国Biosouce公司产品。人IL-12、IFN-γ ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液购自天津灏扬生物公司。乳酸脱氢酶测试盒为美国Sigma公司产品。
       2  方法
       2.1  MCF-7人乳腺癌细胞冻融抗原的制备常规培养MCF-7人乳腺癌细胞，收集并调整浓度为3×107个/ml快冻慢溶反复4次，5 000 r/min离心20 min后取上清液经微孔滤膜过滤作为肿瘤抗原， 4℃保存备用。
       2.2  树突状细胞的培养从健康者外周血中分离单个核细胞（PBMC），培养获得贴壁的DC前体细胞，接种于96孔细胞培养板中培养，分为a、b、c 3组，其中a、b组均加入rhGM-CSF 800 u/ml，rhIL-4的 1 000 u/ml和TNF-α 10 ng/ml，c组不加任何细胞因子。至第3天只在a组中加入冻融法获取的肿瘤抗原50 μl/ml。继续培养，第9天消化，分别收集3组细胞并计数。
       2.3  细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的体外诱导Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得健康者外周血PBMC，用自制的尼龙毛柱进行分离获取T淋巴细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2×105/ml。置于96孔培养板中，每孔1 ml。分为A、B、C、D 4组:前3组分别加入上述收集的a、b、c组细胞（效应细胞与刺激细胞比为40：1），第4组（D组）加入冻融抗原50 μl，每组8个复孔。共同孵育4 d后，部分复孔进行杀伤活性的测定。剩余复孔细胞继续培养至第6天进行IFN-γ，IL-12的检测。
       2.4  CTL s对乳腺癌细胞的杀伤作用将MCF-7，HT-29细胞接种于96孔板中，均分为4组，分别加入以上A、B、C、D组CTL（效靶比40∶1），每组3个复孔，同时设立与实验组对应的同浓度的效应细胞和靶细胞为对照，于培养箱中培养。24 h后离心，取上清液100 μl于4 ml Eppen-dorf管中，按照试剂盒所示方法用乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。
       2.5  IFN-γ，IL-12的检测取上述体外诱导至第6天的CTLs细胞上清液每孔100 μl，按晶美公司ELISA检测试剂盒所示方法测定IFN-γ和IL-12含量。
       2.6  统计学方法实验数据用 ±s表示，应用SPSS12.0统计软件统计分析。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
       3  结果
       3.1  细胞因子IFN-γ和IL-12的检测乳腺癌细胞裂解物致敏后的DC与淋巴细胞一起培养，细胞因子IFN-γ和IL-12的含量比未致敏DC组、单纯乳腺癌细胞裂解物组和单个核细胞对照组高（P＜0.05）。表1  细胞因子IFN-γ和IL-12的检测结果（略）
       3.2  CTLs杀伤活性的检测肿瘤抗原致敏DC组诱导的CTLs对靶细胞的杀伤活性优于未致敏DC组及单核细胞组、单纯抗原组（P＜0.01）。且其对乳腺癌肿瘤细胞（MCF-7）的杀伤活性也明显优于对非乳腺癌肿瘤细胞（HT-29）的杀伤活性(P＜0.01)，见表2。说明肿瘤致敏DC诱导的CTLs杀伤活性具有特异性。表2  不同组CTLs对不同靶细胞的细胞毒活性（略）
       4  讨论
           
       树突状细胞作为机体内免疫反应的始动子和调节子，在机体抗肿瘤免疫反应中极其重要，是近年来免疫学研究中最活跃的领域。
        
       在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给T细胞是导致免疫逃逸的重要原因。同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，特别是DC在数量和功能的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展［4］。利用成熟DC负载肿瘤抗原制备出高效DC疫苗，是目前研究的热点，也是能否诱导肿瘤特异性CTL产生的关健所在［5，6］。目前已研究出多种DC负载抗原的方法［7］，其中冻融裂解法获得肿瘤全抗原，无需明确肿瘤抗原具体的抗原成分，而有多种不同肿瘤抗原成分同时刺激DC，诱导出针对不同抗原决定簇的特异性CTL，该法具有潜在的优势。
        
       从我们的检测结果可以看出负载肿瘤裂解物的DCs分泌IL-12的能力增高了，并且其与CTL分泌IFN-γ的增加呈正相关。这主要是由于IL-12可以影响T细胞的极化方向，由于T细胞上调IFN-γ表达，通过分泌IFN-γ等提高杀伤活性。这些结果表明用IL-12、IFN-γ的分泌来反应肿瘤抗原致敏DC对CTLs的体外诱导可能是一个有用的方法。
        
       本研究中，抗原负载DCs诱导的CTLs对乳腺癌细胞在体外有很好的杀伤活性，与未致敏DC组CTLs及未成熟DC诱导的CTLs组（PBMC组） 有明显差异，说明成熟DC能够呈递肿瘤细胞抗原，激发CTLs的细胞毒作用。而非乳腺癌细胞细胞（HT-29）的杀伤活性较差（P＜0.01），说明这种用负载乳腺癌细胞抗原的DC诱导的CTLs细胞毒作用有其特异性。这种良好的特异性杀伤活性表明肿瘤裂解物致敏的DC疫苗刺激的CTLs的免疫治疗可作为乳腺癌患者新治疗手段，但过渡到临床应用仍需体内实验加以证实。
       【参考文献】
         　［1］戚晓军，赵卫红，王怀瑾.乳腺癌的分子靶向治疗研究进展［J］.中国处方药，2008，73(4):82.
       
       ［2］YanoY，UedaY，ItohT，et al .A new strategy using autologous dendritic cells and lymphokine-activated killer cells for cancer immunotherapy:efficient maturation of DCs by co-culture with LAK cells in vitro［J］.Oncol Rep，2006，16（1）:147.
       
       ［3］曹雪涛.树突状细胞的基础与临床研究新进展［J］.中国免疫学杂志，1998，14（3）:167.
       
       ［4］Schakel K， Mayer E， Federle C， et al. A novel dendritic cell population in human blood: one-step immunomagnetic isolation by a specific mAb(M-DC8) and in vitro priming of cytotoxic T lymphocytes［J］. Eur J Immunol，1998，28(12):4084.
       
       ［5］Imura k， Ueda Y， Hayashi T， Induction of cytotoxic T lym-phocytes against human cancer cell lines using dendritic cell-tumor cell hybrids generated by a newly developed electrofusion technique［J］. Int Oncol，2006，29(3):531.
       
       ［6］张希国，师建国，刘彦仿，等.比较两类树突状细胞激活的肿瘤特异性CTL对肝癌荷瘤裸鼠的治疗作用［J］.肿瘤防治研究，2006，33(7):22.
       
       ［7］Galea LJ， Wells JW， Darling D， et al. Strategies for antigen choice and priming of dendritic cells influence the polariza tion and efficacy of antitumor T cell responses in dendritic cell based cancer vaccination［J］.Cancer Immunol Immunother， 2004，53∶9639.