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       【摘要】 
       目的观察脑心通对氧化低密度脂蛋白(OxLDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 一氧化氮（NO）和内皮素1（ET1）分泌量的影响。方法以培养HUVEC作为靶细胞，在内皮细胞培养基中加入OxLDL（50 mg/L）制备细胞损伤模型，并以不同浓度脑心通含药血清预先进行干预，分别采用硝酸还原酶法和放免法检测细胞上清液中的NO及ET1的含量。结果 OxLDL作用HUVEC 24 h后，HUVEC上清液中NO含量明显降低，而ET1的含量明显升高，均明显高于正常对照组（P＜0.05）；而预先加入脑心通含药血清或阿托伐他汀药液组NO含量明显升高，且在加入步长脑心通含药血清组，这种作用在一定剂量范围内随药物剂量的增加而增强（P＜0.05）。结论步长脑心通能够通过促进内皮细胞NO的合成与释放从而发挥对血管内皮细胞的保护作用，有利于减轻或抑制动脉粥样硬化的形成与发展。
       【关键词】  脑心通； 血管内皮细胞； 氧化低密度脂蛋白； 一氧化氮； 内皮素1
       Effect of  NXT on NO and ET1 of Endothelial Cells 
       LIU Shengqiang, WANG Dongqi, LEI Xinjun, CUI Changcong, LI Hongbing, LIU Qian
       （Cardiovascular Medicine Department ，the First Affiliated Hospital ，Xi"an Jiao Tong University, Xi"an  710061，China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of NaoXinTong (NXT)on the release of nitric oxide(NO)and endothelin-1(ET-1) of human umbilicalvascular endothelial cells (HUVEC) from injury induced by Ox-LDL and to study the therapeutic mechanism of NXT in treating atherosclerosis (AS).MethodsOx-LDL of 50mg/L was used co-incubated with HUVECs for 24h in vitro to establish injury model of HUVEC and NXT containing serum  was applied to implement intervention 12 hours ahead of Ox-LDL. The contents of NO and ET-1 in the supernatant of HUVEC were detected after the experiments.ResultsOx-LDL could significantly inhibit the synthesis of  NO and  increase the secretion of ET-1（P＜0.05）. NXT containing serum and atorvastatin could significantly increase the secretion of NO and moreover the improving effect of NXT containing serum on the secretion of NO was dose-dependent within limited dose（P＜0.05). ConclusionNXT can improve the expression or secretion of NO of HUVECs and exert protective effect on HUVECs. The effect of NXT on HUVECs is beneficial to lightening or inhibiting AS.
       Key words： NaoXinTong (NXT)；  Human umbilical vascular endothelial cell（HUVEC）； Ox-LDL ；  Nitric Oxide(NO) ；   Endothelin-1 (ET-1)
       
       血管内皮的损伤及功能障碍被认为是动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)最早期的事件及AS发病的始动环节［1］。而氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)的形成和对内皮细胞的损伤更是AS发病过程中的重要环节。NO 和ET-1是由血管内皮细胞分泌的一对作用相反的血管活性分子，ET-1与NO的平衡与失平衡与AS的形成有密切的关系。步长脑心通是陕西咸阳步长制药有限公司生产的中成药，具有益气活血，化瘀通络之功效，动物及临床实验都发现其对动脉粥样硬化性心血管疾病具有一定的保护性作用，但对其具体作用机制尚知之甚少，尤其在细胞水平上对其保护性作用的研究报道较少。本研究通过Ox-LDL造成人脐静脉内皮细胞损伤模型，观察步长脑心通对内皮细胞的保护作用及其作用机制，以为其临床防治AS性疾病提供更充分的理论依据。
       1  材料
           
       DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，步长脑心通原粉由陕西咸阳步长制药有限公司提供(国药准字Z20025001)，阿托伐他汀（商品名为立普妥）由大连辉瑞制药公司馈赠，NO试剂盒购于南京建成生物研究所，ET-1试剂盒购于原北京解放军总医院科技开发中心放免所，Ox-LDL购自北京协和医科大学基础所生化教研室。倒置相差显微镜(日本OLympas公司)。
       2  方法
       2.1  HUVEC培养人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)购自中科院细胞库，复苏后用含有10%的胎牛血清的DMEM培养液,于37℃，5%CO2培养箱中培养，用0.25%的胰酶消化传代培养.               
       2.2  脑心通含药血清的制备脑心通1 g药粉相当生药4 g，成人临床用量一般为4.8 g粉/d，选取20只3月龄健康雄性新西兰兔,体重1.8～2.2 kg（由西安交大医学院动物实验中心提供），随机分为5组，空白对照组，并依据动物和人体每公斤体重等效剂量换算后应用将脑心通分4个剂量组（即0.1，0.2，0.4，0.8 g/kg/d），每组4只，将药物粉用蒸馏水配制为10 ml混悬液，每天分两次灌胃，连续5 d，空白对照组给予等容积蒸馏水，第6天给药1次后2 h后心脏取血, 3 000 r/min离心15 min，取上清，经56℃，30 min灭活,0.22 μm滤膜过滤灭菌,-20℃保存备用；取阿托伐他汀一片20 mg碾碎成粉末，先用二甲基亚砜溶解后加入PBS液中充分混合溶解，调节pH为7.30左右过滤除菌分装（浓度为2 mmol/L）药液在加入细胞中干预时进行相应的稀释。
       2.3  分组和干预用药将用0.25%的胰酶消化下来的生长状态良好的HUVEC密度约为1×105个/ml等量接种于24孔板上，然后在含有10%的胎牛血清的DMEM培养液,于37℃，5%CO2培养箱中培养约30 h左右，待细胞融合至95%时换以含有0.5%的胎牛血清的DMEM培养液过夜使其同步化，后将细胞随机分为6组。即对照组，4个不同剂量的脑心通组和阿托伐他汀组，每组复设6个平行孔。对照组和脑心通组给予终浓度为10%对照组或药物组兔血清，而阿托伐他汀组给予终浓度为1μmol/L的药液后于含有3%的胎牛血清的DMEM培养液于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h后取细胞培养上清液进行相关的检测。若不能立即检测于-70℃保存备用。前后分两批次分别用不含有Ox-LDL和含有Ox-LDL（终浓度为50 mg/L）的DMEM培养液进行培养和干预实验。在含有Ox-LDL的DMEM培养液进行干预实验时，上述终浓度的药液于Ox-LDL损伤细胞前12 h预先加入各组细胞中。              
       2.4   NO，ET-1的测定干预完毕后从各组细胞收集的细胞培养上清液采用硝酸还原酶法检测其NO含量，采用放免法测定其ET-1含量。
       2.5  统计学处理为计量资料，数据用±s表示，SPSS13. 0统计软件分析，采用单因素方差分析，实验组与对照组间比较用Dunnett-t检验，多个实验组间比较用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
       3  结果
       3.1  HUVEC形态学变化  在DMEM培养基中不含有Ox-LDL时各组细胞在倒置相差显微镜下为单层互不重叠、呈铺路石状镶嵌排列、细胞呈多角型、边界清楚；而在DMEM培养基中加入了Ox-LDL（终浓度为50 mg/L）时，对照组细胞间隙增宽，细胞收缩变圆，细胞边界不清，少部分细胞脱落；而预先加入了脑心通含药血清组或阿托伐他汀药液组的细胞形态与DMEM培养基中不含有Ox-LDL时的细胞形态相比改变较小。
       3.2  脑心通对Ox-LDL损伤HUVEC前后NO分泌量的影响  在DMEM培养液中未加入Ox-LDL造成细胞损伤时，在一定的脑心通剂量范围内，加入脑心通含药血清后内皮细胞NO的合成与分泌量明显增加，与对照组差异具有显著性（P＜0.05）；而在DMEM培养液中加入Ox-LDL造成内皮细胞的损伤后，内皮细胞的NO的合成与分泌量较前明显减少（P＜0.01），而预先加入脑心通含药血清组或阿托伐他汀药液组内皮细胞NO的合成与分泌量较对照组是增加的，与对照组相比差异具有显著性（P＜0.05）。结果见表1～2。表1  脑心通和阿托伐他汀对生理状态下内皮细胞NO,ET-1分泌量的影响（略）
       3.3  脑心通对Ox-LDL损伤HUVEC前后ET-1分泌量的影响  在DMEM培养液中未加入Ox-LDL造成细胞损伤时，加入脑心通含药血清后内皮细胞ET-1的合成与分泌量未见有影响（P＞0.05），而在DMEM培养液中加入Ox-LDL造成内皮细胞的损伤后，细胞上清液中的ET-1明显增加（P＜0.01），预先加入脑心通含药血清组未见有ET-1含量的明显改变，而在预先加入阿托伐他汀药液组ET-1含量的有明显减少（P＜0.01）。结果见表1～2。表2  脑心通和阿托伐他汀对Ox-LDL(50mg/L)致内皮细胞损伤后NO,ET-1分泌量的影响（略）
       4  讨论
        
       　　血管内皮细胞不但具有屏障功能，而且是一些重要生物活性物质的分泌和效应器官。NO和ET-1便是由血管内皮细胞分泌的一对作用相反的血管活性分子，其相互制约、相互消长以维持血管功能的稳态。在AS发生发展中，NO生成减少为标志的内皮细胞功能失调/障碍被认为是的关键性的第一步，血管内皮细胞功能失调/障碍其特征表现为由内皮细胞产生的NO水平降低及所介导的内皮依赖性血管舒张功能受损 ［2，3］。NO的含量与生物活性的变化能够反映内皮功能的状态，NO功能低下与内皮细胞的损伤过程密切相关。在血管内皮功能失调/障碍时另一个重要的改变是具有强有力的血管收缩效应及促炎症效应的肽物质ET-1的合成释放增加［4］。ET-1可损害内皮细胞NO的产生及下调eNOS的表达［5］，另外 ET-1还能够刺激超氧化物的形成而损害内皮依赖性血管舒张功能［6］。可见NO与ET-1的平衡与血管内皮功能的正常与否密切相关。       
            
         脑心通胶囊主要由黄芪、丹参、当归、川芎、红花等组成,具有益气活血、化瘀通络之效。动物实验和临床研究都发现其对血管内皮具有一定的保护作用［7，8］。现代药理研究［9］证明黄芪对血管内皮细胞的保护作用，另外有研究发现丹参、当归、川芎等药也具有一定的血管内皮细胞保护作用。本研究中观察到在生理状态（即培养基中未加入细胞损伤因素Ox-LDL）时，加入脑心通含药血清后，在一定的药物剂量范围内，内皮细胞NO的分泌量明显增加（P＜0.05），提示脑心通有助于增加或促进正常生理状态下内皮细胞NO的合成或分泌；当内皮细胞受到Ox-LDL损伤后其NO的分泌量明显减少（P＜0.01），而当预先加入脑心通含药血清后，观察到脑心通依然能够促进或增加Ox-LDL损伤后内皮细胞NO的分泌（P＜0.05），表明脑心通还能够促进或增加受损内皮细胞NO的合成或分泌，有助于发挥对血管内皮细胞的保护作用，而且脑心通在一定的药物剂量范围内其促进或增加内皮细胞NO的合成与分泌的作用呈现剂量依赖性（P＜0.05）。另在研究中也观察到Ox-LDL能够促进内皮细胞的ET-1的合成与释放，但未发现脑心通对内皮细胞的ET-1的表达合成有影响（P＞0.05），说明脑心通对内皮细胞的ET-1的表达合成可能没有作用。至于在倒置相差显微镜下行形态学观察时，发现脑心通组和阿托伐他汀组细胞在加入Ox-LDL造成细胞损伤时其形态变化较小,其可能与其能够增加内皮细胞NO的合成与释放，NO发挥了抗氧化损伤等作用有关。                
        
       脑心通是由多种中药材科学配伍而制成的复方制剂，可能含有多种有效成分，董顺福等［10］在中成药的含量分析中发现脑心通中含有10余种宏量、微量元金属元素,而金属元素离子是体内细胞代谢过程中许多酶的辅基，对维持或提高酶的活性发挥着重要的作用, 脑心通或许是提高了eNOS的表达或活性，也可能是有助于增加细胞NO合成所需底物L-精氨酸或辅助因子的水平以及或是减少NO的清除等机制从而促进了NO的合成与释放，这也符合中成药可能具有多途径，多靶点的调节作用。总之,通过本研究发现脑心通不但能够上调或促进生理状态下血管内皮细胞NO的合成与分泌，而且能够上调或促进受损状态下血管内皮细胞NO的合成与释放，调和NO/ET-1间的平衡，从而发挥其对血管内皮细胞的保护性作用，有助于抑制或延缓动脉粥样硬化的形成与发展。至于其上调或促进血管内皮细胞NO的合成与分泌的具体机制尚有待于进一步的研究与探索。
       【参考文献】
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       ［5］Ramzy D, Rao V, Tumiati LC,et al. Elevated endothelin-1 levels impair nitric oxide homeostasis through a PKC-dependent pathway［J］.Circulation,2006,114:319.
       
       ［6］Amiri F, Virdis A, Neves MF, et al. Endothelium-Restricted Overexpression of Human Endothelin-1 Causes Vascular Remodeling and Endothelial Dysfunction［J］.Circulation, 2004, 110: 2233.
       
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       ［8］刘思泰,李德才,云红梅,等. 脑心通对不稳定型心绞痛患者血管内皮功能及超敏C反应蛋白的影响［J］.中药药理与临床，2007,23（3）:77.
       
       ［9］何正光,徐晓玉.黄芪对血管保护作用的药理研究进展［J］.中国药房,2005,16(20)：1589.
       
       ［10］董顺福,韩丽琴,朱志国.治疗心脑血管疾病中成药物微量、宏量元素含量模糊分类研究［J］.第四军医大学学报，2003，24(16)：1492.