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       【摘要】 
       目的分析白花丹参和紫花丹参在蛋白水平的遗传差异。方法利用叶片过氧化物酶和种子贮藏蛋白两种生化标记对白花丹参和紫花丹参进行了分析。结果同工酶分析表明，两种丹参间过氧化物酶同工酶谱存在差异；贮藏蛋白分析表明，丹参种子蛋白主要是以盐溶性蛋白为主，水溶蛋白和醇溶蛋白较少，碱溶性蛋白更少；两种丹参种子贮藏蛋白谱带之间的差异性不明显。结论二者在蛋白水平存在一定差异。
       【关键词】  紫花丹参； 白花丹参； 贮藏蛋白； 同工酶； 聚丙烯酰胺凝胶电泳法； 生化标记
       Biochemical Marker Character Analysis of White Flower Danshen and Violet Flower Danshen
       HAN Linna, Li Hongmei
       （Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China； Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China）
       Abstract：ObjectiveTo analyze white flower Danshen and violet flower Danshen in their 2 biochemical markers (perodiase and storage protein). MethodsTwo biochemical makers of perodiase and storage protein were analyzed.ResultThere was difference in peroxidase PAGE-banding pateerns. Seed proteins of white flower Danshen and violet flower danshen were respectively extracted using distilled H2O,2.5%NaCl, 0.2%NaOH and 75% alcohol. Based on acrylamide gel electrophoresis, most of storage proteins were salt-soluble, water-soluble and aclohol-soluble proteins was less. There was a little alkali-soluble protein. ConclusionThere is difference in storge protein between white flower Danshen and violet flower Danshen.
       Key words：White flower Danshen ;   Violet flower Danshen;   Storage protein;   Isozyme;   PAGE;   Biochemical marker
       
       丹参Salvia miltiorrhiza味苦、性微寒，功能活血祛淤，安神宁心，排脓止痛［1］，临床应用范围较广。就其形态学性状而言，可分白花、紫花两种。传统育种中的形态学鉴定只能揭示外观差异且受环境影响较大，不能完全揭示品种间的遗传差异。生化标记是以基因表达产物蛋白质作为遗传标记，主要包括贮藏蛋白、同工酶和等位酶标记［2］。生化标记分析是一种快速、简便、有效的遗传检测手段。作为生化标记的同工酶、非酶形式的蛋白质，已经被广泛地应用于遗传种质的分离、筛选、品种鉴定以及生物多样性、杂种优势的研究中［3～6］。
       
       本研究利用贮藏蛋白和过氧化物酶同工酶两种生化标记对白花丹参和紫花丹参进行了分析，以期了解其在蛋白质性状水平的遗传差异, 为种质资源的收集和二者药效成分上的比较提供理论依据。
       
       1   材料与方法
       1.1   材料供试材料白花丹参和紫花丹参均由山东中医药大学药圃提供。
       1.2   方法
       1.2.1   过氧化物酶提取  称取1g鲜材料，冰浴研磨，加入1 ml稀释4倍的浓缩胶缓冲液（pH=6.7），冰浴超声提取15 min ，8 000 r/min，0℃离心20 min。上清液加入等体积40%蔗糖溶液混匀，作为供试溶液，可在4℃冰箱内储存备用。
       1.2.2   蛋白质提取  蛋白质提取分为分步提取和一次性提取两种。分步提取主要研究丹参种子中各类蛋白质的组成及比例；一次性提取主要比较在不同提取液的情况下，蛋白质谱带的带型。
       
       分步提取方法：取丹参种子粉碎后称取0.1 g，加入600 μl水，在60℃水浴中提取40 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液备用，再用水按同样方法冲提1次，离心弃掉上清液。然后加入600 μl 2.5% NaCl溶液，用同样方法提取上清液备用，再用2.5%NaCl冲提1次，离心弃掉上清液，用水冲洗1次。再加入400 μl的50%异丙醇提取液，在同样条件下，提取上清液备用。最后加入400 μl  0.2%NaOH，同样条件，提取上清液备用。最后提取的各种蛋白质溶液，和样品处理液（20%甘油，0.1%溴酚蓝，20%浓缩胶缓冲液）等体积混合后用于电泳分析。
       
       一次性提取方法：丹参种子粉碎后分别称取0.05 g，分别加入600 μl水，600 μl 2.5%盐溶液，600 μl 50%异丙醇和600 μl NaOH，在60℃水浴中提取40 min，离心取上清液。按分步提取法加入样品处理液后电泳［7］。
       1.2.3   电泳方法  聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对过氧化物酶和贮藏蛋白进行电泳分析。DYY-III30稳压、稳流型电泳仪（北京六一仪器厂），YY0155-94型电泳槽，采用垂直板凝胶电泳，凝胶板22 cm×10 cm。凝胶为30%丙烯酰胺、1%甲叉双丙烯酰胺，分离胶10%，浓缩胶3%，以TEMED和过硫酸铵为催化系统，以Tris-甘氨酸为电极缓冲液， 150 V稳压条件下电泳4 h。
       1.2.4    染色胶板剥离后，用于跑过氧化物酶的胶放在联大茴香胺染色液中，间歇性摇动，染色2h，拍照。蛋白电泳的胶放在考马斯亮蓝染色液(0.08%考马斯亮蓝，10%三氯乙酸)中染色2 h。
       1.2.5   脱色种子贮藏蛋白电泳的胶放至25%甲醇，10%乙酸溶液中脱色直到看到电泳条带，拍照。
       2   结果
       2.1  丹参叶片过氧化物酶同工酶分析白花丹参在5.1，7.9，8.7 cm处各有1条带，共3条；而紫花丹参在6.3，7.5，8.2，8.7 cm处各有1条带，共4条（见图1）。说明不同表型的丹参品种间在同工酶分析上存在着差异，理论上可以以此作为品种划分的依据之一。
       2.2   丹参种子蛋白质种类的分析用分步提取法对白花丹参和紫花丹参两品种种子提取得到的水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白和碱溶性蛋白电泳结果见图2。由分析结果看出，在丹参种子中以盐溶性蛋白为主，水溶性蛋白和醇溶性蛋白较少，碱溶性蛋白含量极少，在电泳时难以区分。所以在研究丹参种子贮藏蛋白时应以盐溶性蛋白为主。
       1．紫花丹参  2．白花丹参
       图1  丹参叶片过氧化物酶同工酶分析（略）
       Ⅰ：分步提取  Ⅱ：分别提取  1～4：白花丹参　5～8：紫花丹参  1、5：水溶蛋白  2、6：2.5%NaCl盐溶蛋白　3、7：50%异丙醇醇溶蛋白  4、8：0.2% NaOH碱溶蛋白
       图2  丹参种子贮藏蛋白分析（略）
       2.3   不同提取液单一提取蛋白质分析对于同一材料，分别用不同提取液一次性提取，然后电泳。水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白的电泳谱带见图2。结果表明：①不同提取液比分步提取法可得到较清晰的电泳谱带，说明单一提取蛋白含量较高。以盐溶性蛋白的谱带最清晰。②各种提取液提取的蛋白质电泳谱带的条数不同，2.5%NaCl提取的蛋白谱带最多，为5条，分别在2.7，3，3.6，4.2和4.6 cm处；水和50%异丙醇提取的蛋白谱带为中等，均为3条；0.2%NaOH提取的蛋白谱带最少，为1条。③各种提取液得到的蛋白质谱带在白花丹参和紫花丹参之间几乎没有差异。
       3  讨论
       
       丹参叶片的过氧化物同工酶分析表明白花丹参和紫花丹参间存在谱带差异，可以为二者之间在生化标记水平上的差异提供实验依据。但同时也存在着实验重复性不稳定的问题。
       
       丹参种子蛋白以盐溶性蛋白为主，水溶性、醇溶性蛋白较少，碱溶性蛋白最少。电泳分析丹参种子贮藏蛋白时应以盐溶性蛋白为主。不同电泳方法所分离出的蛋白谱带条数、带型和清晰度有较大差异。利用同一电泳方法，电泳条件不同如pH、离子强度、缓冲系统等的差异，也会造成分离效果的差异，所以会得出不同结论。赵华英等［8］对不同丹参种间根茎的蛋白进行比较研究得出不同产地不同丹参品种间水溶性蛋白种类和含量有差异。
       【参考文献】
         　　［1］ 刘陶进,黄耀洲.丹参成分制剂和质量控制研究概况［J］.南京中医药大学学报,1998,14（4）：255.
       
       ［2］ 李 伟,郑有良,魏育明,等.小麦新品种川农16号生化标记性状研究［J］.西南农业学报,2003,16(2):7.
       
       ［3］ 王和勇，乔爱民，陈 敏，等.植物遗传标记的发展及应用［J］.仲恺农业技术学院学报,2000,13(4):58.
       
       ［4］ 王沛政，赖相红，李 涛，等.蛋白质电泳技术在品种真伪和纯度检验上的应用［J］.新疆农业科学,2003，40（5）：296.
       
       ［5］ 凌建群，何祖华，马志超，等.水稻醇溶蛋白的多态性研究［J］.中国水稻科学,1997,11(3)：129.
       
       ［6］ 孙 雁，朱有勇，朱永平，等.蛋白质电泳在豌豆品种鉴定中的应用［J］.种子,2004,23(2)：24.
       
       ［7］ 张春庆,尹燕枰,高荣岐,等.棉花种子蛋白多态性与品种鉴定方法的研究［J］.中国农业科学,1998,31（4）：16.
       
       ［8］ 赵华英,陈永林.苋科6种种子类药材的蛋白电泳鉴别［J］.中国中药杂志,2000,25（1）：53.
       
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