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       【摘要】 
       目的研究白花蛇舌草对人肺巨细胞癌细胞株PG细胞p53基因表达的影响，以探讨其抗肿瘤的作用机制。方法用不同浓度的白花蛇舌草含药血清分别处理人肺巨细胞癌细胞株PG细胞，采用流式细胞仪法观察其对PG细胞p53基因表达的影响。结果经白花蛇舌草含药血清作用的PG细胞p53基因表达水平明显上调。结论白花蛇舌草抗肿瘤作用机制可能与p53基因表达增多有关。
       【关键词】  白花蛇舌草； 肺癌细胞PG； p53； 基因
       Effect of Herba Hedyotis Diffusae  on p53 Gene Expression in PG Cell
       LI Jie
       （Shandong University of TCM, Jinan 250355，China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Herba Hedyotis Diffusae on the expression of p53 gene in vitro. MethodsFCM was used to detect the expression of p53 gene. ResultsThe p53 gene expression of PG cell was increased significantly by Herba Hedyotis Diffusae. ConclusionThe anti-cancer mechanism of Herba Hedyotis Diffusae maybe related to the increase of the expression of p53 gene.
       Key words：Herba Hedyotis Diffusae;   PG cell;   p53；Gene
       
       中药白花蛇舌草Herba Hedyotis Diffusae为茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.的干燥全草，具有清热、利湿、解毒、消痈之功效，主治肺热喘咳、痈肿疔疮、毒蛇咬伤等证，被临床上广泛应用于各种癌症的治疗，尤多用于治疗消化系统肿瘤如食道癌、胃癌、肝癌、直肠癌以及子宫癌、淋巴癌、鼻咽癌等。现代药理研究表明白花蛇舌草具有抗肿瘤、抗菌、消炎等活性。大量研究已表明p53的缺失或突变可引起细胞的生长失控，在多种组织类型的肿瘤中，p53是最常发生变化的抑癌基因之一。本实验研究试图从P53基因表达的角度来探讨白花蛇舌草的抗肿瘤作用机制, 为白花蛇舌草抗肿瘤新药的开发和研制提供依据。
       1   材料与仪器
       
       白花蛇舌草Herba Hedyotis Diffusae购自济南市建联中药店，并由山东中医药大学药学院生药系石俊英教授鉴定。
       
       人肺巨细胞癌细胞株PG细胞，由山东省医学科学院基础所提供。
        
       Wistar大鼠，雄性，体重200～240 g，由山东中医药大学实验动物中心提供。
         
       流式细胞仪(FACScan型,美国BD公司)，倒置相差显微镜（美国AO），CO2培养箱，超低温冰箱，超净工作台(BCM1000型，苏州净化设备有限公司)。
       
       异硫氢酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人p53单克隆抗体和用于免疫阴性对照IgG1-FITC（美国Pharmingen产品），RPMI1640培养基（Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物材料研究所），顺铂(DDP) （齐鲁制药有限公司），胰蛋白酶（GIBCO分装，伯安生命技术有限公司）。
       2  方法与结果［1，2］
       2.1  白花蛇舌草水提取物的制备称取白花蛇舌草200 g，加适量水浸泡1～2 h，水煎煮提取两次，合并提取液，浓缩成一定浓度（剂量为50 g生药/kg），即得白花蛇舌草水提取物。
       2.2  含药血清的制备取Wistar大鼠20只，随机分成正常血清组10只，含药血清组10只。含药血清组每日分别给予白花蛇舌草4 ml/次，2次/d灌胃，正常血清组每日给予等量生理盐水灌胃，连续给药3 d，末次给药后1 h，乙醚麻醉，腹主动脉无菌采血，置无菌离心管离心10 min（1 500 r/min），无菌分离血清，经56℃，30 min 灭活，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装入小瓶，置-20℃冰箱保存备用。
       2.3  流式细胞仪检测取对数生长期的PG细胞，经0.25%胰酶消化，计数，以2×105ml的量接种于培养瓶中，37℃5% CO2含10%小牛血清的1640培养基中培养24 h，至细胞生长旺盛贴壁后，去掉原培养液，分别加入不同浓度的含药血清及DDP，于培养箱中继续培养24 h，0.25%胰酶消化，离心，用PBS液洗涤两次，制成细胞悬液，取200 μl，加P53单抗工作液20 μl，另1支加阴性对照单抗IgG1-FITC，避光反应20 min，上机检测。结果见表1。
       
       共分6组，分组如下：1组10%正常血清组；2组5%白花蛇舌草含药血清组；3组10%白花蛇舌草含药血清组；4组15%白花蛇舌草含药血清组；5组1 μg/ml DDP+10%正常血清组；6组1 μg/ml DDP+10%含药血清组。
       表1  不同浓度白花蛇舌草含药血清对PG细胞p53基因表达的影响（略）
       与正常血清组比较，△P<0.05，△△P<0.01）；与DDP组比较，*P<0.05，**P<0.01；n=5
       3  讨论
       
       肿瘤的发生是一个多基因参与的多步骤的复杂过程，抑癌基因功能的丧失和癌基因的表达是肿瘤发生的主要原因。p53基因是研究得较早、较深入的一个抑癌基因。p53蛋白是核内的一种磷酸化蛋白质，作为转录因子可与特异的DNA序列结合，同时也能作为下游基因的正向和反向转录调控子。其产物p53蛋白能与特异性DNA序列结合并激活转录。p53通过反式激活对细胞增殖起抑制作用，对细胞生长起负调节作用。p53基因的蛋白质产物为野生型p53蛋白。野生型p53蛋白在细胞周期G1期监控细胞DNA损伤，维持细胞正常生长，抑制细胞恶性增殖［3］。细胞非致死性DNA损伤时，野生型p53基因高表达，阻止细胞由G1晚期进入S期，同时上调DNA修复基因转录进行DNA修复。一些外界刺激如离子辐射，DNA损伤等可以引起细胞内p53蛋白水平升高，激活一系列下游靶基因的转录，诱导细胞周期G1期阻断、细胞凋亡和细胞分化，保护基因组的完整性以及抑制肿瘤的发生。
       
       本实验采用流式细胞仪分析不同浓度白花蛇舌草含药血清对PG细胞p53基因表达的影响，结果表明，不同浓度白花蛇舌草含药血清作用于肿瘤细胞后，可出现明显的p53表达水平上调，与正常血清组比较，具有非常显著性差异（P<0.01），而且不同浓度的含药血清对PG细胞的作用存在明显的量-效关系，随着浓度的增高，p53基因表达率增高。白花蛇舌草含药血清与DDP合用，可促使其对PG细胞p53基因的表达，p53基因表达率达60.12%，与单用DDP组比较，具有非常显著性的差异（P<0.01）。提示，白花蛇舌草含药血清可诱导肿瘤细胞促凋亡基因的表达，可能是其抗肿瘤作用的主要机制之一，影响其基因表达的内在因素还有待于进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］ 宋旭红,张月明,刘金宝,等. 阿魏蘑菇提取物对肿瘤细胞p53表达的影响［J］. 中国公共卫生,2003,19(6):690.
       
       ［2］ 孔天翰,林 山,韩雪飞,等. 蝎毒多肽对肿瘤细胞的抑制作用研究［J］. 中国病理生理杂志,2004,20(6):968.
       
       ［3］ 申景岭,闫承慧,傅松滨,等. p53介导的凋亡相关基因的研究进展［J］.国外医学·遗传学分册,2002,25(6):317.