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       【摘要】 
       目的研究补虚祛瘀法促进慢性难愈性创面愈合的机理。方法采用改良付氏大鼠模型为研究对象，分为生理盐水组、复黄生肌愈创油膏组、补虚方组、祛瘀方组、康复新组，运用免疫组化法分别研究各组第18天创面瘢痕组织中转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad3的变化。结果第18天时，复黄生肌愈创油膏组TGF-β1表达高于生理盐水组，而Smad3分子的表达低于生理盐水组。结论瘢痕形成重塑期，补虚祛瘀法对TGF-β1 → Smad3信号转导通路的调控起着重要作用。
       【关键词】  补虚祛瘀法； 创面修复； 瘢痕； Smad3； 转化生长因子β1
       The Effect on Smad3 Signal Transduction by the Method of Reinforce Deficiency and Removing Blood Stasis in the Stage of Cicatricle Remodeling
       QIN Haiguang,HE Changjie,TANG Hanjun
       (Guangxi Traditional Chinese Medical University,Nanning 530001,China;Taian Health School of Shandong Province,Taian 271000,China;Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM,Shanghai 200032,China)
       Abstract：ObjectiveTo research the mechanism of chronicity raw surface coalesced by the method of reinforce dificiency and removing blood stasis.MethodsWe divided rats into five groups:A(group of hpysiologic saline),B(group of Fuhuangshengjiyuchuang factis),C(group of reinforce dificiency),D(group of removing blood stasis) and E(group of Kangfuxin),and then treated them by different therapeutic methods.The changes of TGF-β1,Smad3 by immunohistochemistry at 18th day were observed.ResultsThe express of TGF-β1 of group B was higher than that of group A,while the express of Smad3 of group B was lower than that of group A.ConclusionThe method of reinforce deficiency and remodeling blood stasis can modulate TGF-β1 →Smad3 signal transduction.
       Key words：Chronicity raw surface coalesced;  Cicatricle;  Smad3;  TGF-β1
       
       慢性难愈性创面成因复杂，类型多样，不仅从肉体和精神上给患者带来很大痛苦，同时也加重了社会和家庭的经济负担。中医药治疗慢性难愈性创面具有自身的优势和特色，在中医外科临床中已得到证实。本研究通过观察补虚祛瘀法对创面修复瘢痕重塑期Smad3介导的信号转导通路的影响，以阐明其作用机理，并为中医药治疗慢性难愈性创面提供理论依据。
       1  材料与仪器
       1.1  动物雄性清洁级SD大鼠30只，体重（400±20）g。
       1.2  受试药物组成与制备药物：0.9% NS ；复黄生肌愈创油膏：大黄、鸡蛋黄油、血竭、珍珠粉等；补虚方：  鸡蛋黄油、珍珠粉等；祛淤方：  大黄、血竭等。以上诸药均由上海中医药大学附属龙华医院制剂室提供，同期制备及低温储藏。康复新，由四川佳能达攀西药业有限公司生产，批准文号为ZZ-5643-川卫药准字（1998）第013528号（本品系纯中药制剂）。
       1.3  模型制备用药与试剂新洁尔灭酊，0.9％模型，0.1％盐酸氯胺酮(上海中西药业股份公司生产)。Smad3多克隆抗体，上海博士德公司产品，工作浓度1∶50；TGF-β1 多克隆抗体， Santa  Cruz 公司产品，工作浓度1∶300；Envisim 试剂盒，丹麦DAKO公司产品。
       2  方法
       2.1  动物创面造模采用改良付氏糖尿病慢性难愈合创面大鼠模型方法［1］，雄性清洁级SD大鼠90只，体重（400±20）g，腹腔注射氯胺酮（0.2 ml/只），在无菌条件下用眼科手术剪刀在糖尿病模型大鼠背中部打一圆孔，深至筋膜，直径1.8 cm，创面面积为2.54 cm2 ，创面止血后无菌纱布包扎。
       2.2  动物分组及用药分5个组：生理盐水组、复黄生肌愈创油膏组、补虚方组、祛瘀方组、康复新组。每组6只，均外敷单层浸渍药物的纱布；造模后当天开始给药，每天清洁创面，更换药物1次。  
       2.3  标本采集造模后第10天，用眼科手术剪分离留取各创面新生肉芽组织（500±10）mg。
       2.4  免疫组化实验步骤①共5组标本均用1％中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，同时进行免疫组化Envisim二步法测定Smad3、TGF-β1。②图像分析选择200倍视野，每张免疫组化片任选3个视野，拍照后用 Adobe Photoshop CS 8.0 作分析，数据导入Excel，建立数据库。评定指标：实验结果以细胞及基质显色面积为标准，小于5％为“－”， 5％～10％为“＋/－”，10％～30％为“＋”，30％～50％为“＋＋”，50％～80％为“＋＋＋”，大于80％为“＋＋＋＋”。
       2.5  统计学处理采用SPSS 11.5统计软件包对相关数据进行秩和检验(Kruskal Wallis Test)，并用SAS 8.0统计软件包做多个样本的两两比较。 统计数据以Mean rank和Chi-Square值表示，P<0.05，具有统计学意义。
       3  结果 
       
       见表1。表1表明复黄生肌愈创油膏组TGF-β1表达高于生理盐水组，Smad3表达低于生理盐水组。
       表1  实验性创面18 d肉芽组织中TGF-β1、Smad3的表达（略）
       与生理盐水组比较，*P<0.05
       4  讨论
       
       复黄生肌愈创油膏是在“补虚祛淤”指导思想下配伍组方，专为慢性难愈性创面治疗而设。在多年的临床应用中，证明此油膏不但促愈作用明显，而且愈后瘢痕面积小，质量佳，皮色接近正常，愈后不易复发［2］。
       
       在伤口愈合过程中，TGF-β1信号传递，首先是TGF-β1与其特异性Ⅰ、Ⅱ型受体结合成三元复合物，然后是Ⅱ型受体使I型受体GS区中的丝氨酸/络氨酸激酶发生磷酸化，最后由Smad3蛋白完成细胞内的信号传递［3］。转化生长因子(TGF-β1)是伤口愈合中重要的调控因子，同时也被公认为最强的致纤维化因子，激活细胞内信号转导分子Smad3是其促进胶原合成的必由途径［4］。Smad3介导的信号途径在体内抑制创伤愈合，因为祛除Smad3可引起重上皮化加速和伤口面积的缩小［5］。专家认为调节Smad3在组织修复过程中的表达成为治疗慢性难愈合创面理想的靶点［6］。然而，创面修复是一个动态的病理生理过程，在修复过程中分为连续而又相互重迭的3个阶段，即炎症期、肉芽组织形成期和瘢痕形成重塑期。不同时期的生长因子的表达各异，我们在研究中以TGF-β1 、Smad3为主线，选择皮肤全缺损动物模型第18天时观察不同方剂对创面修复瘢痕形成重塑期信号转导的影响。
       
       第18天时，复黄生肌愈创油膏组TGF-β1表达明显高于生理盐水组，而Smad3分子的表达明显低于生理盐水组。据文献报道Smad3基因缺失不影响成纤维细胞合成和分泌基质［7］。在创伤局部注射野生型单核细胞同样具有刺激基质合成的作用，说明在整个创伤愈合过程中单核细胞能持久地维持局部TGF-β1的水平，提示创床基质合成和沉积不依赖于Smad3［8］。综上分析，我们认为复黄生肌愈创油膏在瘢痕形成重塑期的作用是促进了TGF-β1的合成，促进了成纤维细胞的增殖以及创面基质沉积，从而促进了创面愈合。
       
       综上所述，复黄生肌愈创油膏通过对TGF-β1 、Smad3分子表达的影响，直接调控创面的修复，当然创面修复过程相当复杂，有众多细胞因子的参与以及多种因素的影响，但复黄生肌愈创油膏在整个创面修复过程中对TGF-β1 → Smad3信号转导通路的调控起着重要作用。
       【参考文献】
         　　［1］ 付小兵，王亚平，孙同柱，等. 糖尿病慢性难愈合创面大鼠模型的制备［J］.上海实验动物科学，1997,17(4):217.
       
       ［2］ 唐汉钧，张士云，程亦勤，等. 复黄生肌愈创油膏对减少慢性皮肤溃疡瘢痕形成的临床观察［J］.上海中医药杂志，2001,35(8):26.
       
       ［3］ Chin GS，Liu W,Peled Z, et al，Differential expression of transforming growth factor-beta receptors Ⅰand Ⅱ and activation of Smad3 in keloid fibroblasts［J］.Plast Reconstr Surg,2001,108(2)：423.
       
       ［4］ Chen SJ,Yuan W, Mori Y, et al. Stimulation of typeⅠcollagen transcription in human skin fibroblasts by TGF-beta:involvement of Smad3［J］.J Invest Dermatol,1999：112,49.
       
       ［5］ Yang X , Letterio JJ ,Lechleider RJ ,et al . Targeted disruption of SMAD3 results in impaired mucosal immunity and diministed T cell responsiveness to TGF-beta［J］.EMBO J ,1999,18:1280.
       
       ［6］ Ashcroft GS, Roberts AB, Cytokine. Growth Actor Rev, 2000, 11(1～2): 125.
       
       ［7］ Kretzsc hmar AR, Doody J, Massague J. Trade of between parasitoid resistance an larval competitive ability in Drosophilame lanogaster［J］.Nature,1997,389:618.
       
       ［8］ Ulloa L, Doody J,Massague J. Inhibition of transforming growth factor beta/SMAD signaling by the interfere on garnma/STAT path way［J］ .Nature, 1999,397:710.