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       【摘要】 
       目的探讨补阳还五汤对老年性痴呆(AD)大鼠海马区β淀粉样前体蛋白（β-APP）及相关基因：环氧合酶2（COX-2）、核转录因子抑制蛋白α（IкB-α）、神经元型一氧化氮合酶（nNOS）的影响及可能的作用机制。方法采用Aβ1-40海马区注射，建立AD大鼠模型，免疫组化法观察中药补阳还五汤对AD大鼠海马区β-APP，COX-2，IкB-α及nNOS的影响。结果补阳还五汤能明显降低AD模型大鼠海马区β-APP，COX-2，IкB-α表达，使nNOS表达升高。结论补阳还五汤可能通过COX-2，NF-кB/IкB-α，增加模型大鼠海马区nNOS表达，影响β-APP生成，延缓神经元细胞的早期损伤和迟发性损伤，从而起到治疗AD的作用。
       【关键词】  补阳还五汤； 老年性痴呆； β淀粉样前体蛋白； 环氧合酶α； 核转录因子抑制蛋白α； 一氧化氮合酶
       The Effects and Immunologic Mechanism of Bu Yang Huan Wu Decoction for βamyloid Protein of AD Rats Caused by Aβ1-40
       HAN Yusheng,ZHOU Zhongguang*
       (Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Bu Yang Huan Wu Decoction for βamyloid protein of AD rats caused by Aβ1-40,and  immunologic mechanism.MethodsAD rat model was established with Aβ1～40 by hippocampus injection.Immunohistochemical method was used to detect the expression of βAPP，COX2，nNOS and IKBα in hippocampus of rats.ResultsBu Yang Huan Wu Decoction obviously decreased  the abnormal high expression of β-APP protein;increased the masculine expression of nNOS,and decreased high masculine expression of COX-2 and IKB-α in hippocampus of AD rats caused by Aβ.ConclusionBu Yang Huan Wu Decoction might regulate the generation and metabolism of β-APP,reasonably control the immune inflammation cascade reaction caused by Aβ deposition through signal transduction pathway of COX-2,IKB-α and nNOS.Therefore lessen brain neuronal damage effectually caused by Aβ toxic action,and improve the dysmnesy.
       Key words：Bu Yang Huan Wu Decoction;  Alzheimer"s disease;  β-APP;  COX-2;  IKB-α;  NOS
       
       老年性痴呆(Alzhelmer"sdisease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统的退行性疾病。随着世界老龄化现象的日益严重，AD越来越严重地危害着人们的身体健康。本研究探讨补阳还五汤对AD大鼠海马区β淀粉样前体蛋白（β-APP）及相关基因：环氧合酶2（COX-2）、核转录因子抑制蛋白α（IкB-α）、神经元型一氧化氮合酶（nNOS）的影响及可能的作用机理，为开发中药新药提供实验依据。
       1  器材
       1.1  材料与仪器喜得镇（瑞士山德士药厂与天津华津制药厂联合生产，每片含甲磺酸双氢麦角毒碱1 mg）；Aβ1-40（Amyloid β-protein，Fragment1-40，Sigma公司)。兔抗大鼠β-APP、nNOS和IκB-α，羊抗COX-2；SP试剂盒及DAB剂（北京中山）。大鼠脑立体定位仪SN-2（日本）；Leica-2135切片机（德国Leica）；组织脱水机（德国Leica）；生物组织包埋机（德国Leica）；尼康E600型显微镜（日本尼康）；大鼠跳台仪(医科院药研所)。
       1.2  动物与分组Wistar大鼠70只，雌雄各半，清洁级,体重（300±20）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。适应1周后进行跳台实验，剔除不合格者，称重后随机分成正常组、假手术组、模型组、补阳还五汤组、喜得镇组，每组10只。
       1.3  模型制备［1，2］将Aβ1-40用无菌生理盐水稀释成5 g/L，放置在37℃恒温箱中7 d，形成聚集肽后放入-20℃冰箱中备用。水迷宫测试后48 h，模型组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，参考包新民《大鼠脑立体定向图谱》方法，将大鼠的头固定于立体定位仪上，剪去局部毛发，消毒后沿矢状线切开皮肤，切口长约1.5 cm，将骨膜向两侧推开暴露颅骨。确定海马区注射点：前囟后3 mm，中线向右旁开2 mm，DV 3.5 mm。用牙科钻在颅骨上打孔，钻薄颅骨而不钻透， 用微量注射器稍用力即透颅骨，缓慢注射Aβ1-40溶液2 μl（10 μg），5 min内注射完，留针5 min，牙科泥封住颅骨孔，术区滴庆大霉素，缝合皮肤并消毒，肌肉注射青霉素10万单位，1次/d，连续7  d，防止感染。假手术组不注射Aβ1-40溶液而注入等量无菌双蒸水，其余同模型组。单笼饲养至大鼠完全清醒。
       1.4  治疗方法古方补阳还五汤按原方配伍剂量（黄芪200 g，当归尾10 g，赤芍10 g，地龙5 g，川芎5 g，红花5 g，桃仁5 g），制成水煎剂（含生药2.2 g/ml) ，由黑龙江中医药大学制剂室提供。补阳还五汤组于造模后第7天开始灌胃给予6.5 g·kg-1·d-1，喜得镇组灌胃给予相当于甲磺酸双氢麦角毒碱0.36 mg/kg·d-1，其余各组予以5 ml·kg-1·d-1生理盐水灌胃，连续21 d。
       1.5  指标检测
       1.5.1  脑组织标本的制备各组大鼠于最后1次行为学检测后腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，开胸充分暴露心脏并撕去心包，经左心室行主动脉插管，固定插管并剪开右心耳，先以生理盐水200 ml冲洗至右心耳流出的液体澄清后，再以4%多聚甲醛PBS（pH值7.2～7.4，4℃）200 ml灌注固定，断头取脑。取注射点前后3 mm做冠状切面经固定，石蜡包埋，连续冠状组织切片多套，片厚5μm，裱于经多聚赖氨酸处理的清洁玻片上，60℃烤箱内烘烤2 h后放入4℃冰箱保存，以备各种染色。
       1.5.2  神经病理形态学观察按常规方法对脑组织标本进行苏木素-伊红染色（HE染色）、 刚果红染色（检查病脑组织淀粉样物质沉积）和神经尼氏体染色（甲苯胺篮染色法）。
       1.5.3  β-APP，COX-2，nNOS和IκB-α免疫组化染色免疫组化染色步骤（SP法），按试剂盒说明书操作步骤进行。一抗β-APP， COX-2，nNOS和IκB-α浓度分别为1∶50，1∶50，1∶50和1∶100。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同。
       1.6  免疫组化数据统计阳性细胞数的计算  取每组大鼠脑组织切片7张，每张切片于海马区随机选取5个区域，在400×显微镜下计算此区域内的免疫组化染色为阳性细胞数。由两名人员独立观察最后取平均值，结果以±s表示。各组间数据采用社会科学统计程序软件SPSS10. 0进行t 检验。
       2  结果
       2.1  神经病理形态学变化正常组和假手术组：HE染色显示大鼠皮质和海马形态完整，神经元数量多，细胞排列整齐，结构致密，形态正常，分布均匀，胞内结构正常，染色正常。刚果红染色阴性，尼氏小体丰富清晰。
       2.1.1  模型组HE染色显示大鼠海马结构异常，神经元细胞明显减少，锥体细胞带紊乱、变稀、中断，数量减少，同时可见许多细胞体积缩小，胞核固缩，染色加深，伴有大量的小胶质细胞增生；刚果红染色呈阳性反应，神经元尼氏小体着色淡，结构紊乱不清晰。
       2.1.2  治疗组与模型组大鼠相比，各治疗组大鼠皮质和海马形态均有不同程度的恢复，以补阳还五汤组最为明显， HE染色显示神经元数量较模型组增多，细胞排列较整齐，结构致密，形态较正常，分布比较均匀，胞内结构较正常，染色正常。刚果红染色弱阳性，尼氏小体着色较深，欠清晰。
       2.2  β-APP免疫组化结果β-APP免疫反应阳性物质呈棕黄色细小颗粒，定位于细胞的胞膜和胞浆。阳性细胞在正常组和假手术组皮层和海马均有弱表达，在模型组海马区阳性反应强度明显高于正常组和假手术组，与前两组比较，差异显著（P＜0.01）。补阳还五汤组和喜得镇组分别与模型组相比，β-APP免疫反应强度明显降低，阳性细胞个数明显减少（P<0.05或P<0.01）；补阳还五汤组、喜得镇组之间阳性细胞数比较无统计学意义（P﹥0.05）。结果见表1。
       2.3  COX-2在各组大鼠海马区表达COX-2免疫反应阳性物质呈棕黄色，定位于细胞的胞膜。阳性细胞在正常组和假手术组皮层和海马均有弱表达，在模型组反应强度明显高于正常组和假手术组，与前两组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比补阳还五汤组和喜得镇组COX-2免疫反应强度明显明显减弱，阳性细胞数减少（P<0.05或P<0.01）；治疗组与正常组相比较，反应强度变化不太明显，但阳性细胞数还是较高；补阳还五汤组和喜得镇组各组间比较无统计学意义（P﹥0.05）。结果见表2。
       2.4  nNOS在各组大鼠海马区表达在光镜下可见nNOS阳性物质积聚于胞浆和突起内，着色细胞大小不等，着色深浅不一，大多为卵圆形，少数为圆形。模型组nNOS阳性细胞数明显低于正常组和假手术组（P<0. 01），而且细胞着色很浅。与模型组相比补阳还五汤组和喜得镇组大鼠皮质及海马内nNOS细胞的表达近似于正常，细胞着色较深（P<0.05或P<0.01）。结果见表3。
       表1  各组海马β-APP阳性细胞数（略）
       与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；n=7
       表2  各组大鼠海马区COX-2表达（略）
       与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；n=7
       表3   各组大鼠海马区nNOS表达（略）
       与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；n=7
       2.5  IкB-α在各组大鼠海马区表达IкB-α免疫反应阳性物质呈棕黄色，定位于细胞的胞浆。阳性细胞在正常组和假手术组皮层和海马均有弱表达，在模型组反应强度明显高于正常组和假手术组，与前两组比较，差异显著(P＜0.01)。与模型组相比补阳还五汤组和喜得镇组IкB-α免疫反应强度明显减弱，阳性细胞数减少(P<0.05或P<0.01)；治疗组与正常组相比较，反应强度变化不太明显，但阳性细胞数还是较高。 结果见表4。
       表4  各组大鼠海马区IкB-α表达（略）
       与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；n=7
       3  讨论
       
       AD的神经病理学特征是老年斑(SP)形成、神经元纤维缠结(NFT)和神经元的缺失。神经元损害、认知损害和记忆丧失的程度与β-淀粉样物质沉积范围有关。研究认为，β-APP→Aβ→SP→神经元损伤→智能障碍→痴呆，β-APP / Aβ与SP的形成关系密切。SP是老年性痴呆的病理学变化之一，大量存在于AD患者的大脑皮层、海马区。Aβ凝聚和聚积是AD病理发生、发展的起始因素，其它的病理改变如脑内神经元F缠结、神经元功能紊乱和丢失等，均被认为是由于Aβ的解离与凝集、清除与产生的失衡所引起的。老年斑的主要成分是纤维化和非纤维化的β淀粉样蛋白，在AD患者脑内，这种平衡被破坏，Aβ通过自身聚集形成难溶的沉淀，并生成老年斑，这是发生AD的关键环节。
       
       慢性炎症不仅可以刺激正常细胞增殖、转化以及恶变，还可以激活炎症相关的信号转导通路，其中环氧合酶2（COX-2）、核转录因子NF-кB（nuclear transcription factor， NF-кB）在机体炎症反应调节过程中具有重要的调节作用。
       
       COX-2呈诱导型表达，在生长因子、细胞因子、炎症介质、激素等刺激因素作用下，表达迅速上调，其催化产生的PGs在炎症反应中发挥重要作用。研究显示长期慢性炎症或其他因素作用下COX-2持续表达则有促进血管生成［3］；抑制细胞凋亡［4］作用。
       
       NF-кB是一种重要的核转录因子，在内皮细胞的活化中起重要作用，与脑损伤、脑血管疾病关系密切［1，2］。NF-кB/IкB-α系统在血管内皮细胞激活中起着关键作用。IкB-α和NF-кB结合后干扰核转录信号，阻止NF-кB进入核内发挥作用； IкB-α还干扰核内的NF-кB与特定的DNA序列结合并解离已形成的NF-кBDNA复合物，终止NF-кB的持续作用。因此，IкB-α在NF-кB活化的途径中起着最关键的分子开关作用［5］。NF-кB中许多在免疫和炎症反应中起重要作用的细胞因子、黏附因子等关键调解因子，它能结合到编码这些因子基因的结构域上的启动子或增强子上。NF-кB的过量活化可导致NF-кB调控反应物的大量产生，是许多疾病的病理过程［6］。COX-2启动子上具有NF-кB-5"、 NF-кB-3"这两个NF-кB结合位点，NF-кB可以诱导COX-2蛋白表达［7，8］，抑制NF-кB可以导致COX-2表达完全抑制。因此NF-кB与COX-2间存在密切的关系。
       
       NO作为中枢神经系统细胞间信使分子，在学习记忆机制中具有重要作用。NOS是催化产生内源性NO的唯一酶类，并因NO的非囊泡释放、高度弥散和半衰期极短等特征而在很大程度上决定着NO的生物学效应，其中n NOS可能是参与学习记忆机制的关键酶。 NOS通过调节NO的生成，参与海马长时程增强效应（LTP）的形成和维持。
       
       根据COX-2、NF-кB/IкB-α和NOS分子生物学特点及本实验显示的表达情况，我们推测在炎症等刺激下，通过一系列信号转导引起IкB-α降解，导致NF-кB-IкB复合物解体，NF-кB活化进入细胞核，诱导细胞因子、黏附分子、NOS等基因表达，这些物质都直接或间接地参与AD的炎症反应，导致神经元的损伤。NF-кB与COX-2基因上的启动子结合，从而可以引起COX-2蛋白表达增强。然而，NF-кB持续表达则可能导致COX-2过度表达，引起神经细胞炎症性增生，成为早期事件并在其中起到重要作用。
       
       中医中并无AD的名称，但根据其主要临床表现 应归属于“神志病”的范畴。本病主要与脏腑功能失调、气血运行失常有关， 特别是心气血不足、神失所养为其发生发展之本，而痰滞淤阻、机窍不利为其标［9］。古方补阳还五汤是补气活血名方，临床治疗脑缺血效果显著，近年有人将其应用于老年痴呆的防治。方由黄芪、党参、茯苓 远志、川芎等中药组成。黄芪、党参功擅补元气，安神增智；桂枝温通心脉， 活血利水 ；茯苓为“治痰主药”，兼具安神；远志宁心安神，化痰通窍；赤芍、川芎不仅活血行气 且有升散之性，能上行头目。全方具有益心气、通心阳、化痰通窍活血之功效，实为标本兼顾之方［10］。
       
       通过实验研究表明，补阳还五汤可能通过抑制AD脑中IкB-α的表达，使NF-кB活性下降，从而调控脑组织免疫炎性细胞因子、COX-2和nNOS等基因表达；减少中性粒细胞浸润，有效地减少神经元及星形胶质细胞退行性改变，通过合理控制免疫炎症级联反应减轻脑组织神经元损伤。
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