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       【摘要】 
       目的观察地黄的3个炮制品对血虚小鼠的补血作用。方法应用环磷酰胺腹腔注射和综合放血造成小鼠血虚模型，观察地黄不同炮制品对血虚小鼠外周血象、CFU-E、BFU-E和CFU-GM的影响。结果与酒炖熟地组相比，生地组明显增强血虚小鼠骨髓粒系祖细胞的生成能力，并能升高外周血白细胞数；其他各组相比，酒炖熟地组显著增强血虚小鼠骨髓红系祖细胞的生成能力。结论不同地黄炮制品对血虚小鼠补血作用是通过不同的机制实现的。
       【关键词】  生地黄； 清蒸熟地； 酒炖熟地； 血虚； 补血
       Study on the Blood Enrichment of Three Different Processed Products of Radix Rehmanniae
       CUI Ying,FANG Xiaona,WANG Huixia,LI Jun
       （Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou,Henan 450008 China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of three different processed products of Dihuang on blood deficiency of mice. Methods The blood deficient models in mice were induced by intraperitoneal injection of cyclophosphamide or by limiting diet and chronic bleeding . Three different processed products of Dihuang were used in treating the models and the effects on the peripheral blood of the mice of blood deficiency and on the CFU-E，BFU-E and CFU-GM were observed. ResultsRadix Rehmanniae enhanced capacity of proliferation of granulocyte progenitor cell and increased the total numbers of WBC; Radix Rehmanniae praepared by yellow wine stewing enhanced capacity of proliferation of erythroid progenitor cell.ConclusionThe different processed products of Radix Rehmanniae can enrich the blood by different mechanism.
       Key words：Radix Rehmanniae;   Prepared rhizome of rehmannia by steam;   Radix Rehmanniae prapared by yellow wine stewing;   Blood deficiency;   Enrich the blood
       
       地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch. 的块根［1］，始载于《神农本草经》，被列为上品。历代本草均有记载，为常用中药之一。由于炮制方法的不同，有鲜地黄、生地黄及熟地黄等不同品种。生地黄性寒，具有清热凉血、养阴生津的功效，制后可使药性由寒转温，味由苦变甘，功效由清转补，具有补血滋阴、益精填髓功效。其制法有加酒、不加酒等。传统观点认为，蒸制后可使药性由寒转温，味由苦转甜，功能由清转补；酒制后且可借酒力行散，起到行药势，通血脉，更利于补血，使地黄补而不腻。药理研究表明熟地黄有一定程度的补血作用［1］，但地黄不同炮制品补血作用的比较研究尚未见报道，因此我们开展了以下研究。
       1   器材
       1.1   药物 地黄选用河南温县产道地药材玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch的干燥根。生地（河南省焦作市武陟县永盛药材加工厂怀药种植基地提供）、清蒸熟地、酒炖熟地（河南省焦作市武陟县永盛药材加工厂提供），经河南中医学院中药标本馆刘若庸教授鉴定。生地、清蒸熟地、酒炖熟地，经水煎、过滤、浓缩至1∶1， 4℃备用。按《中药药理研究方法学》［2］计算小鼠的等效剂量为4.5 g·kg－1·d－1 。
       1.2    仪器和试剂全自动血球计数仪，日本Sysmex-820；CO2培养箱，Napco-5410；光学显微镜，Nipon产品；定量取血管，北京红星区医疗设备厂产品；环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号050108；马血清，北京元亨圣马生物技术研究所产品，批号050529；Epo，南京华欣药业产品，批号20010303；C6，杭州九源产品。
       1.3   动物昆明种小鼠，体重为（20±2）g，购自军事医学科学院动物实验中心，动物合格证号2005－011。二级动物饲养室饲养。
       2  方法
       2.1   地黄不同炮制品对环磷酰胺所致血虚小鼠补血作用的比较研究
       2.1.1   动物分组及模型制备  昆明种小鼠常规饲养数天适应环境后，按体重随机分组：正常对照组、模型对照组、生地组、清蒸熟地组、酒炖熟地组。除正常对照组外，其余各组于实验第1天按250 mg/kg剂量一次腹腔注射环磷酰胺［3］，制成贫血模型小鼠。各给药组分别灌胃相应的药物，给药量为9.0 g·kg-1·d-1，1次/d，每次0.2 ml/10 g，连续10 d，正常对照组、模型对照组给予等体积的生理盐水。
       2.1.2    检测指标 
       
       外周血象的检测：在造模前，造模后1，3，5，7，9，12，15，18 d不同检测时间点，每只实验小鼠尾静脉取血20 μl，用Sysmex-820全自动血球计数仪检测外周血象。
       
       造血祖细胞的培养：造模后第10天，每组处死3只小鼠，按文献方法［4］进行集落培养，计算细胞集落数，以此反映小鼠骨髓CFU-E，BFU-E和CFU-GM的生成能力。
       2.2   地黄不同炮制品对综合放血法所致血虚小鼠补血作用的比较研究
       2.2.1    动物分组及模型制备  昆明种小鼠，常规饲养数天适应环境后，按体重随机分为：正常对照组、模型对照组、生地组、清蒸熟地组、酒炖熟地组。除正常对照组外，其余各组小鼠隔2 d放血0.4 ml，每天按100 g·kg-1·d-1体重限食［5］，在第15天停止造模，观察9 d结束。各给药组于造模第1天给予相应的药物，给药量为9.0 g·kg-1·d-1，1次/d，每次0.2 ml/10g，正常对照组、模型对照组给予等体积的生理盐水，连续15 d。
       2.2.2    检测指标
       
       外周血象的检测：在造模前，造模后3，6，9，12，15，18 d不同检测时间点，每只实验小鼠尾静脉取血20 μl，用Sysmex-820全自动血球计数仪检测外周血象。
       
       造血祖细胞的培养：造模后第10天，每组处死3只小鼠，按文献［4］方法进行集落培养，计算细胞集落数，以此反映小鼠骨髓CFU-E，BFU-E和CFU-GM的生成能力。
       3  结果
       3.1    地黄不同炮制品对环磷酰胺所致血虚小鼠补血作用的比较研究
       3.1.1    地黄不同炮制品对环磷酰胺所致血虚小鼠外周血象的影响结果表明，环磷酰胺一次腹腔注射造模后，模型对照组外周白细胞在制模3 d后降至最低点，然后短暂回升后又稍下降，一直显著低于正常对照组。生地在第9天显著升高外周血白细胞（P＜0.01），清蒸熟地在第3，7天显著升高白细胞（P＜0.05），且与酒炖熟地有显著差异。清蒸熟地、酒炖熟地在18 d能显著升高外周血红细胞数（P＜0.01），且显著高于生地。见表1～2。
       表1  地黄对环磷酰胺所致血虚小鼠外周血白细胞的影响（略）
       与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与酒炖熟地组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=10
       表2  地黄不同炮制品对环磷酰胺所致贫血小鼠外周血红细胞的影响（略）
       与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.05；与酒炖熟地组比较，△P＜0.05；n=10
       3.1.2    地黄不同炮制品对环磷酰胺所致血虚小鼠骨髓造血祖细胞的影响 结果表明，模型组小鼠CFU-E，BFU-E和CFU-GM的生成能力较正常对照组明显减弱（与正常对照组比P＜0.01），说明环磷酰胺造模后小鼠骨髓的造血能力受到抑制。酒炖熟地显著增加红系早幼、晚幼祖细胞（CFU-E，BFU-E），酒炖熟地对CFU-E，BFU-E生成能力的恢复显著高于其它各组；生地、清蒸熟地能增加粒系祖细胞CFU-GM，且显著高于酒炖熟地。见表3。
       3.2    地黄不同炮制品对综合放血法所致血虚小鼠补血作用的比较研究
       3.2.1    地黄不同炮制品对综合放血法所致血虚小鼠外周血红细胞的影响  结果表明，模型组小鼠自造模之日起至造模结束，外周血红细胞与正常组比较有显著差异；生地组在给药3，9，15 d时外周血红细胞与模型组有显著差异，清蒸熟地在给药3，6，15 d时外周血红细胞与模型组有显著差异，酒炖熟地在给药3，6，9，15 d时外周血红细胞与模型组有显著差异。见表4。
       3.2.2    地黄不同炮制品对综合放血法所致血虚小鼠骨髓造血祖细胞集落数的影响结果表明，模型组小鼠CFU-E ，BFU-E ，CFU-GM与正常组均有显著差异，生地组、清蒸熟地、酒炖熟地均有显著增加CFU-E；酒炖熟地能显著增加BFU-E。见表5。
       表3  地黄对环磷酰胺所致贫血小鼠造血祖细胞集落数的影响（略）
       与正常对照组比较，**P＜0.01 ；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；n=3
       表4  地黄对综合放血法所致血虚小鼠外周血红细胞的影响（略）
       与正常对照组比较，*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001 ；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；n=10
       表5  地黄对综合放血法所致血虚小鼠造血祖细胞的影响（略）
       与正常对照组比较，*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001 ；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲▲P＜0.01；n=3
       4  讨论
       
       文献记载生地黄味甘、性寒、归心肝肾经，其功效清热、凉血、养阴生津，用于热病烦渴、内热消渴等阴虚内热证以及热入血分的各种出血症等；熟地黄味甘、性温、归肝肾经，有补血滋阴、益精填髓之功，用于血虚、肾阴不足、肝肾精血亏虚等血虚证和阴虚证等。生地、熟地均有一定程度的补血作用。
       
       以环磷酰胺诱发的血虚证模型和综合放血法诱发的血虚证模型小鼠都表现出外周血象数值的降低，骨髓CFU-E，BFU-E和CFU-GM的生成能力下降，但以环磷酰胺诱发的血虚证模型小鼠外周血象以白细胞数量降低最为显著，综合放血法诱发的血虚证模型小鼠外周血象以红细胞、血红蛋白数量降低最为显著，本实验结果和文献报道的相一致［2，4，5］，血虚造模成功。本研究观察了地黄不同炮制品对环磷酰胺和综合放血法两种方法造成的血虚小鼠的影响，结果发现对环磷酰胺所致的血虚小鼠，生地和清蒸熟地均显著升高外周血象白细胞，且与酒炖熟地有显著差异；清蒸熟地和酒炖熟地能显著升高外周血红细胞数，且显著高于生地。在综合放血法所致的血虚小鼠，地黄不同炮制品在不同时间点升高外周血红细胞数，以酒炖熟地效果最优，且酒炖熟地能显著升高外周血红蛋白；生地、清蒸熟地、酒炖熟地对血虚证小鼠骨髓CFU-E生成能力的恢复均有显著的促进作用，清蒸熟地对BFU-E生成能力的恢复有显著的促进作用。
       
       结果提示，生地主要靠刺激粒系造血祖细胞升高外周血白细胞数而达到补血作用；熟地主要通过刺激红系造血祖细胞升高外周血红细胞而达到补血作用。
       
       致谢：本实验得到中国军事医学科学院放射医学研究所高月、谭洪玲的指导和帮助，在此表示衷心感谢！
       【参考文献】
         　　［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社,1999：7.
       
       ［2］ 陈 奇. 中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社,1996:1103.
       
       ［3］ 马增春,高 月,刘永学,等.四物汤对环磷酰胺所致血虚证小鼠造血细胞作用的研究［J］.中国实验方剂学杂志,2001,7（5）:13.
       
       ［4］ 刘秀珍. 造血祖细胞培养技术实验手册［M］.北京:北京出版社,1993:25，92.
       
       ［5］ 谭 玮,宋崇顺,谭洪玲,等.四物汤对综合放血法所致小鼠血虚证造血功能的影响［J］.中国中药杂志,2005,30（12）:926.