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       【摘要】 
       目的研究中药灯盏细辛对神经母细胞瘤 （SH-SY5Y） 细胞神经型尼古丁受体表达的影响及其对抗β淀粉样蛋白 （Aβ）神经毒性作用机制。方法采用比色法测定细胞 MTT 还原率筛选药物浓度安全范围，选取一定浓度的灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位处理 SH-SY5Y 细胞后，再加入 Aβ1-42 处理，测定 MTT 还原率，蛋白质印迹法（Western blotting ）方法测定神经型尼古丁受体 α3、α7 蛋白表达的变化；采用改进的Ellman比色法测定细胞培养基中乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）及丁酰胆碱酯酶（Butyrylcholinesterase，BuChE）活性。结果灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能提高细胞 α3 及 α7 尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平；降低细胞乙酰胆碱酯酶活性；并能对抗 Aβ 引起的MTT还原率降低。结论灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能上调尼古丁受体亚单位蛋白表达水平，降低细胞乙酰胆碱酯酶活性，且能对抗 Aβ 的神经毒性作用，在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用。
       【关键词】  灯盏细辛； SH-SY5Y细胞； 尼古丁受体； β-淀粉样蛋白； 胆碱酯酶； 阿尔茨海默氏病
       Neuroprotective Effects of Herba Erigeromtis against the Aβ Neurotoxicity
       QI Xiaolan,HUANG Yong, WANG Yonglin, WANG Aimin,GUAN Zhizhong*
       （Department of Molecular Biology, Guiyang Medical University, Guiyang 550004, PR China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of Herba Erigeromtis on the expression of nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) and the anti-neurotoxicity mechanism of the drug by using neuroblastoma SH-SY5Y cells treated with beta-amyloid peptide.MethodsThe SH-SY5Y cells were treated by Herba Erigeromitis, and then exposed to Aβ1-42. MTT reduction assay was used to choos a safe-dose concentration of Herba Erigeromitis and to understand the influences of the drugs on cellular viability resulted from the treatment of Aβ; expressions of α3 and α7 nAChR subunits at protein level were detected by Western-blotting. The levels of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) activities in cell culture mediums were meatured by an improved Ellman‘s colorimetric method. ResultsHerba Erigeromtis stimulated increases of α7 and α3 nAChR proteins in the cultured cells; decreased the activity of AChE and inhibited the decreased MTT reduction resulted from Aβ. ConclusionHerba Erigeromtis can upregulate the expression of nAChR subunits at protein level, decrease the activity of AChE and prevent the decreased MTT reduction induced by Aβ. The drugs might play an important role in therapeutic strategy of AD.
       Key words： SH-SY5Y cells;   nAChR;   β-amyloid pepitide;   Alzheimer disease;   cholinesterase;   Herba Erigeromtis
       
       阿尔茨海默氏病（Alzheimer"s disease， 简称AD）是一种主要在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性变疾病，其主要临床表现为进行性认知功能障碍、记忆力衰退、性格和行为改变等［1～3］。近一个世纪以来，众多的科学家就AD的病因及发病机制进行了大量的研究，但其发病机制至今尚不十分清楚。目前认为AD是由遗传学因素、环境因素和代谢因素等多种因素共同作用所引起的一种疾病，病理学上以脑细胞内神经原纤维缠结及细胞外老年斑形成为主要特征［1］。老年斑的主要成分为β淀粉样蛋白，是一种神经毒性物质，可以引起神经元的损伤和死亡，是AD发病过程中的一个重要因素，能促进AD的发生和发展。
       
       神经型尼古丁乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptor, nAChR )（或称尼古丁受体）与学习和记忆等认知功能密切相关，并具有明显的神经保护作用［4］。在较早的一些研究中就发现，AD患者大脑皮层nAChR出现持续和严重的丢失，大脑皮层nAChR缺失与AD患者认知障碍有显著的相关性。胆碱酯酶（Cholinestease，ChE）是一类丝氨酸水解酶，其功能主要为水解兴奋性神经递质乙酰胆碱。可分为两类，乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase, AChE）与丁酰胆碱酯酶（Butyrylcholinesterase，BuChE）。近几年的研究表明，AChE和BuChE在AD的发病过程中起着重要的作用，且它们的水解底物ACh缺失的严重程度与痴呆密切相关［5］。在AD 病人脑中，总AChE 的酶活性是下降的，然而在老年斑中以及其周围AChE活性却是升高的，其能促进Aβ的聚集，并加速其沉淀，形成不可溶的淀粉样斑块 ［6］。
       
       由于AD的发病机制复杂，尽管世界各国在寻找有效治疗药物的研究中投入了大量人力和物力，但成果却十分有限，目前世界上最为成熟和成功的方法是采用胆碱酯酶抑制剂（Cholinestease inhibitor，ChEI），以提高患者脑内ACh的水平、补偿胆碱能功能的缺失，也是唯一一种通过美国FDA批准用于治疗AD的药物［7］。但是，胆碱酯酶抑制剂只能缓解AD的临床症状，而无法达到根治的作用。中药是我国独特的资源，在治疗上具有多途径、多靶点、毒副作用较小等特点，中医药学从整体观念出发，辨证论治，并积累了丰富的经验。灯盏细辛具有抗血栓,抗缺血,脑缺血再灌注神经损伤保护作用，且灯盏细辛乙醇提取物显示β-淀粉样肽聚集抑制活性［8］。本研究用Aβ1-42处理来源于人脑的神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞作为研究对象，以研究灯盏细辛神经保护作用机制。
       1  试剂及样品
         
       灯盏细辛由贵阳医学院药学院制备、提供，灯盏药材以95％乙醇提取2次，回收乙醇后，以水混悬，取样。混悬水溶液醋酸乙酯萃取数次，醋酸乙酯层合并回收溶剂得灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位。
       
       D-MEM培养液购自Gibco Invitrogen公司（英国）；源于人脑的神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y细胞）购于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司（德国）；羊抗 α3、α7 及鼠抗 β-肌动蛋白（β-actin ）多克隆抗体及HRP标记的抗羊及抗鼠二抗购自Santa Cruz Biotechnology Inc (美国)。聚乙烯二氟（PVDF）膜、ECL-Plus发光试剂、高效显影胶片购自Amersham公司；胆碱酯酶测定试剂及其它化学试剂均购自Sigma公司。
       2  方法
       2.1  细胞培养，β-淀粉样肽及灯盏细辛的处理先用含15％胎牛血清的 DMEM 培养液培养 SH-SY5Y 细胞，待细胞生长稳定后，改用不含血清的 DMEM 培养液继续培养，培养箱中含5% CO2，温度为37 ℃。在 SH-SY5Y 细胞中加入1μmol/L的Aβ1-42，培养48 h。为观察灯盏细辛对Aβ毒性作用的影响，先加入3mg/mL灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位培养24 h后，再加入 1μmol/L　Aβ 1-42培养48 h。
       2.2  3-4,5-二甲基噻唑-2,5-二酚四唑溴化物［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT ］测定MTT是一种四甲基偶氮唑盐，经活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化可生成蓝紫色的还原型MTT，该产物在490 nm波长处有极大的吸收峰。比色法测定MTT水平［9］，常用来表示细胞的损伤程度和功能状况。
       
       为筛选灯盏细辛的安全浓度，选择0.05～10 mg/ml 浓度处理 SH-SY5Y 细胞后24 h后测定MTT还原率，以检测其对细胞是否具有毒性作用及其安全浓度范围。
       2.3  尼古丁受体亚单位蛋白表达测定参照 Guan 等［10］的方法进行提取细胞膜蛋白及用西印迹（Western blotting）方法检测 α3，α7 nAChR亚单位蛋白水平。以Labworks软件分析结果时以β-Actin蛋白条带作为内参照，计算α3、α7 nAChR蛋白条带与β-Actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为α3、α7 nAChR蛋白质表达的相对水平比。
       2.4  体外培养的细胞胆碱酯酶活性测定收集细胞培养基，加入的培养基量按照蛋白定量的结果使其含有相同的蛋白质克数。96孔酶标板每孔总体系为200 μl，每孔加培养基10 μl，按表1加样。
       表1  细胞胆碱酯酶活性测定（略）
       于室温避光处准确反应15 min后，在酶标仪412 nm波长下比色。
       
       计算公式为：AChE或BuChE活性单位=2.941×OD（测定值-对照值）
       2.5  统计学分析每组所得结果用±s表示，结果用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析。*P<0.05或**P<0.01表示差异有显著性或高度显著性意义。
       3  结果
       3.1  中药安全浓度筛查灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位在所选浓度范围内对 SH-SY5Y 神经细胞 MTT 还原率无明显影响，表明其对细胞毒性作用较小。因此选择 3 mg/ml 作为本次研究灯盏细辛的选用浓度（图1）。
       图1  经不同浓度灯盏细辛乙醇提取物乙酸乙酯部位处理的SH-SY5Y神经细胞MTT还原率 （略）
       3.2  药物处理后 MTT 还原率测定药物处理后 MTT 还原率测定发现，1μ mmol/L Aβ1-42处理细胞后引起MTT 还原率明显降低；3 mg/ml 灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位处理细胞不影响细胞功能；而用灯盏细辛预处理细胞后可明显减弱 Aβ 对细胞的毒性作用，Aβ 组与灯盏细辛+Aβ组之间的差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
       3.3  尼古丁受体亚单位蛋白表达水平α3 及 α7 nAChR亚单位蛋白质表达水平结果表明，灯盏细辛处理细胞可上调细胞 α3 及α7 nAChR亚单位蛋白质表达水平（P<0.01）。见图3。
       3.4  细胞胆碱酯酶测定结果细胞经3 mg/ml灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位处理组AChE活性值为（11.69±1.21） nmol·min-1·ml-1，较空白对照组的（15.86±0.47）nmol·min-1·ml-1　降低26.29％，差别存在统计学意义（P<0.05）。
       
       各处理组BuChE活性值分别为：空白对照组（10.88±0.33） nmol·min-1·ml-1，灯盏细辛乙醇提取物处理组1（1.16±1.23） nmol·min-1·ml-1。两组间BuChE活性值差别无统计学意义（P>0.05）。 SH-SY5Y神经细胞经灯盏细辛及Aβ处理后MTT还原率测定，结果用单因素方差分析法统计分析 (n=6)， **表示与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）；＃表示与Aβ处理组相比差异有统计学意义（P<0.05）。
       Con：对照组；Aβ：Aβ处理组，DZXX：单纯灯盏细辛处理组，DZXX+Aβ：灯盏细辛和Aβ处理组
       图2  SH-SY5Y神经细胞药物处理后MTT还原率（略）
       SH－SY5Y细胞经灯盏细辛处理后，用Western blotting法测定SH-SY5Y神经细胞α3及a7尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平，结果用单因素方差分析法统计分析 (n=6)， **表示与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。
       Con：对照组，DZXX：灯盏细辛处理组
       图3  SH-SY5Y神经细胞药物处理后α3及α7尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平（略）
       4  讨论
       
       大量研究已经证明在 AD 脑组织中老年斑的主要成分Aβ是由其前体蛋白（β-Amyloid precursor peptide, APP）经分泌酶 β- 和 γ- 水解后形成的，具有一定的神经毒性作用。近来也有研究表明，Aβ的损伤作用是 AD 发生发展的首要因素［11］。本研究用 Aβ1-42 处理来源于人类的 SH-SY5Y 神经细胞，模拟 AD 患者脑内神经细胞的病理过程，以此作为灯盏细辛体外研究的类 AD 细胞模型。研究结果显示，与对照组相比，Aβ1-42 处理组 SH-SY5Y神经细胞的 MTT 还原率明显降低，进一步证实 Aβ- 可引起神经细胞的损伤。实验还发现，灯盏细辛预处理的SH-SY5Y神经细胞能够对抗Aβ引起的MTT 还原率降低，进一步表明该中药具有抗 Aβ细胞毒性的作用。
       
       神经型尼古丁受体是神经系统中一类非第2信使介导性神经递质结合的离子通道，与学习和记忆关系密切，是一类明确的具有神经保护功能的受体，其减少与 AD 的发生有关［12］。AD 病人脑内尼古丁受体-配体结合率降低，其亚基的蛋白表达水平也降低［13］。目前寻找可上调 nAChR 且副作用小的药物是治疗AD药物研究的方向之一。在SH-SY5Y神经细胞中，a3 和 a7 是主要的尼古丁受体亚类。本研究中，通过测定nAChR α3 和 α7 亚单位蛋白质水平发现，灯盏细辛乙醇提取物能够明显地上调 α3 和α7 nAChRs 蛋白质的表达水平，说明在治疗 AD 药物的选择中灯盏细辛可能具有重要的作用。
       
       ChE能通过水解胆碱而发挥生理功能。中枢神经系统的AChE及胆碱能受体参与完成神经与神经之间动作电位的传递过程，AChE能迅速水解乙酰胆碱（Acetylcholine，Ach）生成胆碱和乙酸，发挥终止神经冲动传递的作用［5］。近几年的研究表明，AChE和BuChE在AD的发病过程中起着重要的作用，它们的水解底物ACh缺失的严重程度与痴呆密切相关［14］。AD病人脑中总体的AChE活性下降，然而在老年斑中以及其周围AChE活性却是升高的。迄今为止，在AD的治疗上，世界上最为成熟和成功的方法是采用胆碱酯酶抑制剂（ChEI），以提高患者脑内ACh的水平、补偿胆碱能功能的缺失。但是，胆碱酯酶抑制剂只能缓解AD患者的临床症状，无法达到根治的目的。本研究表明灯盏细辛乙醇提取物乙酸乙酯部位能降低细胞AChE活性，这说明了其可能具有类似胆碱酯酶抑制剂的功能。对于AD的治疗可能具有一定的作用。
       
       综上所述，灯盏细辛具有上调 α3，α7 nAChR 亚单位蛋白质表达的作用；可抑制细胞乙酰胆碱酯酶活性；灯盏细辛在细胞整体水平有抗 Aβ 的神经细胞毒性作用；其作用机制可能与其刺激 nAChR 表达有关，灯盏细辛可能在 AD 的治疗中发挥重要作用。
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