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       【摘要】 
       目的研究灯盏花素(Bre)对2型糖尿病(T2DM)大鼠肾脏肥大的抑制作用与机制。方法建立T2DM大鼠模型，给予灯盏花素腹腔注射治疗，测定大鼠血糖、血脂、总胆固醇、血清胰岛素水平、肾脏肥大指数和单根近端小管(PT)钠泵活性。结果与正常对照组比较，T2DM模型组血糖、血脂、总胆固醇水平都显著升高；胰岛素敏感指数(ISI)显著降低；6周组大鼠PT钠泵活性显著升高，但12周组大鼠PT钠泵活性显著降低；12周组肾脏肥大指数显著升高。与模型对照组比较，Bre治疗组血糖、血脂、总胆固醇水平都显著降低；6周组大鼠PT钠泵活性显著降低，但12周组大鼠PT钠泵活性显著升高；ISI显著升高；12周组肾脏肥大指数显著降低。结论Bre能抑制T2DM大鼠肾脏肥大，其机制可能与降低血糖、血脂和总胆固醇水平，升高ISI和稳定PT钠泵活性有关。
       【关键词】  灯盏花素; 2型糖尿病; 肾脏肥大; 钠泵; 大鼠
       The Inhibitory Action and Mechanism of Breviscapine on Kidney Hypertrophy in Type 2 Diabetic Rats
       LUO Lei, LIU Hong*
       (Zunyi Medical College, Zunyi 563003, China; North Sichuan Medical College, Nanchong 637100, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of breviscapine (Bre) on kidney hypertrophy in type 2 diabetic rats.MethodsFemale Wistar rats were developed a rat model of type 2 diabetes mellitus (T2DM). The 6 week group and 12 week group diabetic rats received Bre (10 mg·（kg·d）-1. The following parameters were measured: the blood sugar, blood fat, total cholesterol level, KW/BW, insulin sensitivity index (ISI)，sodium pump activity of PT. Results①Compared with normal control group, blood sugar, blood fat and total cholesterol in the model control group significantly increased, ISI significantly decreased, KW/BW significantly increased in 12w group, sodium pump activity of PT significantly increased in 6w group but significantly decreased in 12w group (P<0.01 or P<0.05)；②Compared with model control group, blood sugar, blood fat and total cholesterol in the Bre treatment group significantly decreased (P<0.01 or P<0.05), ISI significantly increased (P<0.01)，the KW/BW were significantly decreased in 12w group, sodium pump activity of PT were significant decrease in 6w group but significant increase in 12w group. ConclusionBre can inhibit kidney hypertrophy, it may be caused by the decrease of blood sugar, blood fat, cholesterol and increase of ISI and stabilization of sodium pump activity of PT in T2DM rats.
       Key words：Breviscapine;   Type 2 diabetes mellitus;   Kidney hypertrophy;   Sodium pump;  Rats
       
       2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患病率近年来快速增长，寻找到有效、价廉和毒副作用小的中草药用于T2DM的防治具有重要的意义。灯盏花素(breviscapine, Bre)是从灯盏花中分离出的一类黄酮类成分，主要含灯盏乙素（4,5,6-三羟基黄酮-7葡萄糖醛酸苷）、少量灯盏甲素和其它黄酮成分［1］，临床主要用于心血管疾病的治疗。据报道，Bre能够使糖尿病患者和链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱发的糖尿病肾病大鼠的尿蛋白减少，减轻肾脏肥大［2，3］，但其机制尚不确定。肾小管，特别是近端小管(proximal tubule, PT)管周膜上的钠泵，是肾脏实现其功能的最重要的功能蛋白。在糖尿病患者，PT钠泵活性的变化可能早于肾脏形态和结构的改变，本实验室前期证实了T2DM大鼠早期PT钠泵活性升高［4］，但是1型糖尿病大鼠出现肾脏肥大时肾皮质钠泵活性和mRNA的表达降低［5］，所以，本实验以Bre腹腔注射治疗T2DM模型大鼠，观察Bre对模型大鼠肾脏肥大的抑制作用及肾脏PT钠泵活性、胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index , ISI)等的影响。
       1  器材与方法
       1.1  材料与仪器灯盏花素(昆明龙津药业公司)，STZ(瑞士Alexis公司)，总胆固醇、甘油三酯检测试剂盒(南京建成生物公司)，胰岛素放射免疫检测试剂盒(北京北方生物技术研究所)，Na2ATP、哇巴因(ouabain, Sigma)，胶原酶Ⅱ、EGTA(Gibco)，［γ-32P］ATP(北京福瑞特公司)。快速血糖测定仪及(三诺SXT-1型，长沙)，SN-6930A型液闪仪与SN-6100型γ计数器(上海核所日环光电公司)。
       1.2  动物及饲料3月龄雌性Wistar大鼠，清洁级，体重(200±18)g。常规饲料：57%碳水化合物，22%蛋白质，6%脂肪，8%纤维素，7%其他成分。高能饲料(60%常规饲料，20%蔗糖，20%猪油)［6］（广东省医学动物实验中心提供）。
       1.3  方法
       1.3.1  动物模型建立与分组T2DM大鼠模型和正常对照组的建立参照本实验室以前的方法［4］。造模大鼠4周高能饲料喂养后给予25mg·kg-1的STZ一次性腹腔注射，继续高能饲料喂养4周，然后采尾静脉血测定空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS)，并计算胰岛素敏感指数(ISI) ［7］，最后选取符合T2DM条件的24只大鼠作为T2DM模型(建模成功率70%)，其余淘汰。实验动物设立三大组，每组再设立两小组(n=6)，分别用于Bre治疗6周和12周的实验及对照：正常对照组(A1, A2)；模型对照组(B1, B2)，Bre治疗组(C1, C2）。治疗组经前期预试，选用最合适的Bre剂量(10 mg·kg-1·d-1，临用前用5 g·L-1羧甲基纤维素钠配制成2.5%的混悬液），对照组每日注射等量的羧甲基纤维素钠溶液，在Bre治疗期间，全部大鼠都用常规饲料喂养，自由饮水。实验动物分别于Bre治疗6周末和12周末空腹12  h，然后从心脏采血并立即处死，收集双侧肾脏标本，用滤纸吸干水分，去包膜，称重，右侧肾脏-70℃冻存备用，左侧肾脏用于PT的分离和钠泵活性测定。
       1.3.2  生化及放免检测血糖采用快速血糖测定仪测定，血甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)测定均采用721分光光度计，胰岛素水平（FINS）测定采用放射免疫分析法。
       
       1.3.3  单根PT的获取及其钠泵活性测定参照我们以前的方法获得大鼠单根PT并测定小管钠泵活性［8］。获得的单根小管经过低渗冻融处理后，与1 μl总ATPase测定液或Mg-ATPase测定液共同孵育，37℃ 15 min，液闪仪测定孵育液中32Pi的每分钟计数(cpm)值，利用Concet公式计算出总ATPase或Mg-ATPase活性，两者差值即钠泵的活性，酶的活性用单位用pmol·mm-1·h-1表示。
       1.4  统计学处理 采用SPSS10.0软件对各组数据行单因素方差分析，计量结果以±s表示，P<0.05为统计学检验标准。
       2  结果
       2.1   灯盏花素对T2DM大鼠一般症状体征的影响与正常对照组大鼠比较，建立的T2DM模型大鼠体重明显增加，并出现腹型肥胖、多饮、多尿、多食的症状，毛发色泽黯淡，精神萎靡，活动减少，随着病程延长，除大鼠体重呈下降趋势外，其它症状更加明显；与模型对照组大鼠比较，Bre治疗6周后，上述症状体征得到改善，治疗12周后，情况更进一步好转。    
       2.2   灯盏花素对T2DM大鼠生化指标和肾脏肥大指数的影响由表1可见，与正常对照组比较，6周和12周时，糖尿病模型对照组大鼠TC，TG，FBG水平显著升高（P<0.05或P<0.01），肾脏肥大指数6周时无显著差异(P>0.05)，但12周时显著增大(P<0.05)；与模型对照组比较，Bre治疗6周和12周后，大鼠TC，TG，FBG水平显著降低，肾脏肥大指数12周时显著降低(P<0.05)。
       表1  实验大鼠血清生化指标和肾脏肥大指数的变化（略）
       与相应对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；n=6
       2.3  灯盏花素对T2DM大鼠血清胰岛素水平和胰岛素敏感指数的影响 表2可见，与正常对照组比较，6周和12周时，糖尿病模型对照组大鼠FINS水平显著升高，ISI显著降低(P<0.01)；与糖尿病模型对照组比较，Bre治疗6周和12周后，大鼠FINS水平显著降低，ISI显著升高(P<0.05)。
       表2  灯盏花素对T2DM大鼠血清FINS、ISI和PT钠泵活性的影响（略）
       与相应对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；n=6
       2.4   灯盏花素对T2DM大鼠肾脏近端小管钠泵活性的影响  如表2，与正常对照组比较， T2DM模型对照组大鼠6周时 PT钠泵活性显著升高，12周时PT钠泵活性显著降低(P<0.01)；与糖尿病模型对照组比较，Bre治疗6周后，PT钠泵活性升高的效应被显著抑制(P<0.01)，治疗12周后，PT钠泵活性降低的效应也被显著抑制(P<0.01)。
       3  讨论
       
       人类的糖尿病主要是T2DM，因此，建立和选择尽可能符合人类T2DM的动物模型，是研究的关键。从本实验的结果看，疾病模型大鼠具有中度高血糖、高血脂，血清胰岛素水平不低但胰岛素敏感性显著下降的特点，同时还具有多饮多食多尿和精神活动下降的症状，这与人类T2DM的症状和体征十分类似。T2DM模型大鼠经过Bre注射液治疗6周和12周后，血糖、血脂和总胆固醇水平明显降低，ISI显著升高，糖尿病“三多一少”的症状也得到一定程度改善，表明注射Bre对T2DM具有一定的治疗作用。
       
       近年来有研究表明肾小管病变较肾小球病变对肾功能的影响更大，且小管间质纤维化程度与肾功能衰竭程度密切相关，肾小管上皮细胞损伤后的改变被认为是肾间质纤维化的起始因素［9］。肾小管钠泵活性可以反映小管的功能状态，实验结果显示T2DM大鼠6周时PT钠泵活性显著升高，这可能是血糖血脂升高，肾小管内高血糖高血脂对小管管周膜的刺激，使钠泵活性代偿性升高，此时肾脏功能还处于代偿初期，未发生器质性改变，肾脏未见肥大。
       
       实验结果反映，Bre治疗6周后，PT钠泵活性升高的效应被抑制，其原因可能是Bre治疗后，糖尿病大鼠ISI升高，血糖水平下降，同时血脂和胆固醇水平也下降，肾小管内血糖血脂浓度下降，对管周膜上钠泵的刺激作用减弱导致钠泵活性下降。糖尿病模型大鼠12周时，肾脏已经显著肥大，肾PT管周膜上钠泵活性也显著降低，此时肾脏的功能已转为失代偿阶段。研究表明，长期的高血糖，能够激活肾小球细胞内的蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)，而PKC能使钠泵磷酸化而降低活性。由于Bre对PKC具有显著的抑制作用［10］，所以12周治疗组，PT 钠泵活性降低的效应也得到显著抑制， 肾脏也未出现明显肥大，表明Bre能够稳定T2DM大鼠PT钠泵活性，延缓肾损害的进程。
       
       据此推断，Bre对T2DM肾脏损害的保护作用与稳定PT钠泵活性有关，Bre对肾脏PT钠泵活性影响的机制，可能与降低血糖血脂水平和抑制PKC的活性有关。
       【参考文献】
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