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       【摘要】 
       目的探讨丹参酮ⅡA（Tan ⅡA）对脑缺血再灌注损伤大鼠B细胞淋巴瘤/白血病基因2（Bcl2）及B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x（Bax）蛋白表达的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、Tan ⅡA低剂量治疗组和Tan ⅡA高剂量治疗组。线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。Tan ⅡA高、低剂量治疗组分别于术前连续灌胃给予相应剂量Tan ⅡA 3 d，1次/d。除假手术组外的各组于脑缺血90 min再灌注24 h，进行HE染色观察病理形态学变化和神经症状评分，免疫组化法观察大鼠额顶部皮质Bcl-2和Bax蛋白表达。结果Tan ⅡA高、低剂量治疗组脑组织缺血损伤病理学改变明显轻于缺血再灌注组，Tan ⅡA高剂量治疗组缺血改变亦轻于低剂量治疗组。Tan ⅡA高、低剂量治疗组神经功能缺失评分较缺血再灌注组降低（P<0.05）。与假手术组比较，缺血再灌注组Bcl-2和Bax表达增加， Bcl-2 /Bax比值下降（P<0.05）。与缺血再灌注组比较，Tan ⅡA高、低剂量治疗组均显著增加Bcl-2表达、减少Bax表达，上调Bcl-2 /Bax比值，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。结论Tan ⅡA对缺血再灌注脑损伤具有保护作用，其机制可能与通过增加Bcl-2表达，减少Bax表达，上调Bcl-2 /Bax比值抗凋亡有关。
       【关键词】  缺血再灌注； B细胞淋巴瘤/白血病基因2； B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x； 丹参酮ⅡA
       Effect of Tanshinone ⅡA on Expression of Bcl-2 and Bax after Cerebral Ischemic Reperfusion Injury in Rats
       LI Hao, FENG Junlin,LIU Kaixiang
       （The Affiliated Hospital of Guilin Medical College ,Guilin 541002,China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of Tanshinone ⅡA (Tan ⅡA)  on expression of Bcl-2 and Bax of cerebral ischemia reperfusion（I/R）injury in rats. MethodsIn this experiment, rats were randomly divided into 4 groups, which were sham operated group, I/R group,low dose Tan ⅡA treated group and high dose Tan ⅡA treated group. The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occluded method.Rats were pretreated with Tan ⅡA ,ig for 3 d,respectively  before MCAO.After 90min MCAO following 24 h of reperfusion, HE staining and the neurological score were investigated . Expression of Bcl-2 and Bax were also investigated with immunohistochemistry. ResultsThe changes of ischemic impairment in low and high dose Tan ⅡA treated groups  were lighter than in IR group,and  was lighter in high dose Tan ⅡA treated group than in low dose Tan ⅡA treated group. Compared with IR group, the neurological score was decreased in low and high  dose Tan ⅡA treated group (all P<0.05). Compared with sham operated group ,expression of Bcl-2 and   Bax increased at 24h of reperfusion in the ischemic territory(P<0.05);and the ratio of  Bcl-2 /Bax was decreased .Compared with I/R group, low and high dose Tan ⅡA treated group increased expression of Bcl-2 and  reduced expression of Bax dose-dependently (P<0.05), the ratio of  Bcl-2 /Bax was increased .ConclusionTan ⅡA may reduce cerebral ischemia-reperfusion injury by increasing the expression of Bcl-2  and  decreasing the expression of Bax. It plays protective effect from apoptosis through increasing the ratio of  Bcl-2 /Bax.
       Key words：Ischemia-reperfusion;   Bcl-2;   Bax；  Tanshinone ⅡA
       
       丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvin miltiorrhiza Bunge的干燥根部，味苦，性微寒，具有活血祛淤、安神除烦、凉血消痈功效。近年来在缺血性脑血管病防治中被广泛应用。曲友直等［1］研究发现，丹参对脑缺血再灌注时细胞凋亡有抑制作用。丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，Tan ⅡA） 为丹参中脂溶性有效成分，其对脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响尚未见报道。本实验采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研究丹参酮ⅡA对大鼠脑缺血再灌注损伤B细胞淋巴瘤/白血病基因2（Bcl-2）和 B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x（Bax）蛋白表达的影响，探讨其保护作用的可能分子生物学机制。
       1  动物与分组
       
       健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，质量(250±30) g，共40只（广西医科大学动物实验中心提供）。按随机分组原则分成假手术组（10只）、缺血再灌注组（10只）、Tan ⅡA低剂量治疗组（10只）及Tan ⅡA高剂量治疗组（10只）。
       2  方法
       2.1  给药途径与药量TanⅡA低剂量治疗组（15 mg/kg）和高剂量治疗组（30 mg/kg）均于术前连续灌胃给药3 d，1次/d，假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水灌胃。第3天给药后1 h对缺血再灌注组及TanⅡA组建立局灶性脑缺血90 min再灌注24 h动物模型。
       2.2  动物模型的建立 参照Longa等［2］方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。线栓采用石蜡线栓。线栓直径约0.27 mm，插入深度约18 mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注。神经功能缺陷评分：按照 Longa等［2］评分标准，各组分别在再灌注24 h进行评分。正常，无神经学征象为0分；动物不能完全伸展右前肢为1分；动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象为2分；动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚为3分；无自发活动，有意识障碍为4分。神经功能缺陷评分在1～3分为模型成功。假手术组前期操作同缺血再灌注组，但线栓只插到颈内动脉和颈外动脉分叉处。
       2.3  Bcl-2和Bax的免疫组化染色 再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端7～11 mm之间冠状切取约5 mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成蜡块，连续切片，厚5 μm。连取5张，1张作HE染色，其余4张作免疫组化染色。用SP法进行Bcl-2和Bax蛋白的免疫组化染色。一抗由北京中山生物技术有限公司提供。阴性对照片用PBS液代替一抗。在细胞质内出现棕黄染色颗粒染色代表Bcl-2和Bax蛋白阳性表达细胞。于每个鼠脑取1张切片，每张切片分别随机选取左侧大脑半球额顶部皮质5个不重复高倍镜视野（400×），计数每个视野阳性细胞数，算出平均数即为每张切片阳性细胞数。
       2.4  HE染色取再灌注24 h大鼠脑切片进行常规HE染色，观察病理形态学改变。
       2.5  统计学方法 数据处理采用SPSS11.5统计软件进行运算，结果以±s表示。组间差异显著性检验采用方差分析。
       3  结果
       3.1  TAN ⅡA对神经功能评分的影响 见表1。假手术组无神经功能缺陷。与假手术组比较, 缺血再灌注组神经功能评分明显升高(P＜0.05) ；TAN ⅡA高、低剂量治疗组大鼠的神经功能评分低于缺血再灌注组(P＜0.05) ，高、低剂量组之间差异无显著性（P>0.05）。
       表1  TAN ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分的影响（略）
       与假手术组比较，*P<0.05；与缺血再灌注组比较，△P<0.05；与TAN ⅡA低剂量治疗组比较，★P>0.05；n=5
       3.2  TAN ⅡA对脑组织病理学改变的影响假手术组脑组织切片可见神经细胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，锥体细胞核大而圆，核仁明显（见图1）。缺血再灌注组呈缺血改变，梗死区正常组织结构消失，结构不清，间质水肿，有炎细胞浸润；锥体细胞体积缩小，细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红。部分细胞坏死，并可见呈筛状坏死的坏死灶（见图2）。Tan ⅡA不同剂量治疗组脑组织缺血改变较缺血再灌注组明显减轻，坏死范围缩小，细胞结构较完整，细胞核固缩少，细胞间质水肿轻，高剂量组与低剂量组之间比较，缺血改变更轻。
       图1  假手术组大鼠脑组织HE染色（200×）（略）     
       图2  缺血再灌注组大鼠再灌注24h脑组织HE染色（200×）（略）
       
       3.3  TAN ⅡA对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响结果见表2。假手术组Bcl-2和Bax少量表达。缺血再灌注组Bcl-2和Bax阳性细胞表达增多，Bcl-2阳性细胞形态较饱满，Bax阳性细胞部分呈条索状，表达部位主要分布于缺血半暗带的额顶皮质，Bcl-2 /Bax比值较假手术组下降，差异有统计学意义(P＜0.05)（见图3～4）。与缺血再灌注组比较，TAN ⅡA高、低剂量治疗组的BCL-2阳性细胞增加，Bax阳性细胞下降，Bcl-2 /Bax比值较缺血再灌注组升高 (P＜0.05)，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。
       表2  TAN ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠Bcl-2 和Bax的影响（略）
       与假手术组比较，*P<0.05；与缺血再灌注组比较，△P<0.05; 与TAN ⅡA低剂量治疗组比较，☆P<0.05；n=5
       图3  缺血再灌注组Bcl-2阳性细胞表达（SP染色，400×）（略）
       图4  缺血再灌注组Bax阳性细胞表达（SP染色，400×）（略）
           
       4  讨论
       
       胡霞敏等［3］研究发现，Tan ⅡA能减小缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积。本研究结果也证实，脑缺血再灌注损伤给予Tan ⅡA治疗也可明显减轻缺血病理损害，高剂量Tan ⅡA的保护效果更显著,同时Tan ⅡA可提高缺血大鼠的神经功能评分，减轻神经功能缺失症状，表明Tan ⅡA对缺血再灌注脑损伤有保护作用。
       
       研究表明，脑缺血后神经元的死亡主要表现为坏死和凋亡两种形式。细胞凋亡是在生理和病理条件下的一种主动死亡方式,是受细胞内、外因子调控的生物学过程。在脑缺血急性期，神经元坏死与凋亡并存，细胞坏死位于缺血中心区，细胞凋亡主要出现在缺血半暗带。抑制细胞凋亡发展、防止损伤区域扩大, 是治疗缺血性脑损伤的关键。而凋亡的机制受到细胞内某些特定的凋亡调节基因的调控, Bcl-2基因和Bax基因表达的变化被认为是脑缺血后细胞凋亡的主要分子机制［4］。Bcl-2是与脑缺血神经元凋亡关系最密切的内源性凋亡抑制基因［5］，Bax则是与Bcl-2作用对抗的促凋亡基因。Bcl-2、Bax蛋白分别是上述两种基因的蛋白质表达产物, 在细胞内动态共存, 体现两种基因表达的动态关系。Bcl-2的过度表达与Bax构成异源二聚体而阻抑细胞凋亡，当Bax过量时，形成Bax-Bax同源二聚体可促进细胞凋亡。因此，细胞内这两种蛋白之间的动态关系可以用Bcl-2/Bax比值来表示, 而Bcl-2 /Bax比值的高与低，可能决定细胞在受到凋亡刺激信号后, 是趋向于存活还是死亡。当Bcl-2/Bax> 1时, 对细胞凋亡起抑制作用, 细胞趋于存活; 当Bcl-2/Bax < 1时, 对细胞凋亡起促进作用, 细胞趋于死亡［6，7］，本研究中，缺血再灌注组Bcl-2和Bax阳性细胞表达增多，部位主要分布于缺血半暗带的额顶皮质，且Bcl-2 /Bax比值下降且< 1，这一方面表明Bax在脑缺血损伤再灌注时表达增加 ,形成同源二聚体促进细胞凋亡 ,另一方面Bcl-2 表达的上调也许反映了在邻近半暗带生存神经元一种保护性的生存机制 ,使其免于受亚致死量的损害导致神经细胞死亡；而Bcl-2/Bax比值缺血再灌注组与假手术组比较降低，表明缺血再灌注组凋亡细胞增加。Tan ⅡA干预后，Bcl-2阳性细胞表达上升，Bax阳性细胞表达下降， Bcl-2 /Bax比值上升且> 1，这表明Tan ⅡA 可通过增加Bcl-2表达，降低Bax表达，增加Bcl-2与Bax结合成异源二聚体量可发挥抗凋亡作用，抑制了缺血后细胞凋亡的发展, 延缓或阻止缺血区域尤其是周边区神经细胞的死亡进程, 在一定程度上挽救了受损的神经细胞, 从而防止最终梗死灶的扩大，对缺血再灌注脑损伤起到一定的保护作用，并且高剂量Tan ⅡA的保护效果更显著。
       【参考文献】
         　　［1］ 曲友直，高国栋，胡佩珍，等. 丹参、黄芪对脑缺血再灌后BCL -2 蛋白表达影响的实验研究［J］. 西北国防医学杂志，2001，22 (3)：268.
       
       ［2］ Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occusion without cranietomy in rats［J］.Stroke,1989,20(1)：84.
       
       ［3］ 胡霞敏，周密妹，胡先敏，等.丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用及对能量代谢的影响［J］.中国临床药学杂志，2006，15(3)：176.
       
       ［4］ Ouyang YB, Giffard RG. Cellular neuroprotective mechanisms in cerebral ischemia: Bcl-2 family p roteins and protection of mitochondrial function［J］. Cell Calcium, 2004, 36：303.
       
       ［5］ GrahamSH,ChenJ,Clark1RS1Bcl-2family gene products in cerebralIschemia and traumatic brain injury［J］.J Neurotrauma,2000,17：831.
       
       ［6］ Isenmann S, Stoll G, SchroeterM, et al. Differential regulation of Bax, Bcl-2, and Bcl-X proteins in focal cortial ischemia in the rat［J］. Brain Pathol, 1998, 8：49.
       
       ［7］ Schabitz WR, Sommer C, Zoder W, et al. Intravenous brain-derived neurotrophic factor reduces infarct size and counterregulates Bax and Bcl22 expression after temporary focal cerebral ischemia［J］. Stroke，2000，31：2212.