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       【摘要】 
       目的建立高效液相色谱（HPLC）法测定欧亚旋覆花中绿原酸的含量。方法采用色谱柱为Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm,5.0 μm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）；流速为1.0 ml/min；检测波长为326nm。结果绿原酸在0.20～8.0 μg范围内线性关系良好（r=0.999 6），回归方程为Y=5 342.2X+1 960.5。平均回收率为100.42%，RSD为1.9%。结论该法简便、准确，重现性好，可用于测定欧亚旋覆花中绿原酸的含量。
       【关键词】  绿原酸； 欧亚旋覆花； 高效液相色谱法
       欧亚旋覆花为菊科植物欧亚旋覆花Inula britannica L.的干燥头状花序，性味苦、辛、咸、微温，归肺、脾、胃、大肠经，具有降气、消痰、行水、止呕的功效，常用于风寒咳嗽，痰饮蓄结，胸膈痞满，喘咳痰多，呕吐噫气，心下痞硬［1］。文献报道欧亚旋覆花所含主要化学成分有黄酮类化合物［2～4］、萜类［5，6］、挥发油［7］、多糖［8］以及酸类化合物等，具有抗炎镇痛、抗肿瘤和抗氧化等［9］活性。绿原酸具有抗菌消炎作用，是欧亚旋覆花的有效成分之一。在2005版《中国药典》中无含量测定项。为了有效控制药材质量，我们用HPLC法测定了7个不同产地欧亚旋覆花中绿原酸的含量。现报道如下。
       1  仪器与材料
       
       Agilent 1100 series 高效液相色谱仪（G1310A 四元泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1314A紫外检测器）；GR-202型电子分析天平（A&D Company）；KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
       
       乙腈为一级色谱纯（美国）, 水为重蒸水并经0.45μm滤膜过滤，其它试剂均为分析纯。绿原酸对照品购自中国药品生物制品检定所，批号为110753-200212；实验药材分别采购于山西、甘肃、江苏、河南、安国等地，经河北医科大学生药教研室聂风禔教授鉴定为菊科植物欧亚旋覆花。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件 Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm×250 mm,5.0 μm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）；柱温30℃；检测波长326 nm；流速1.0 ml/min；进样量20 μl；在该色谱条件下，样品中绿原酸峰与其它非被测成分峰能够达到基线分离，对照品与样品的色谱图见图1。
       2.2  对照品溶液的制备  精密称取干燥的绿原酸对照品约10 mg,置100 ml棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀,即得（每毫升含绿原酸0.1 mg，10℃以下保存）。
       2.3  供试品溶液的制备  将60℃减压干燥5 h的花粉碎，取粉末约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min,放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
       2.4  线性关系考察  配制绿原酸对照品溶液浓度为0.40 mg/ml，稀释，使绿原酸的浓度分别为0.20，0.10，0.05，0.02，0.01 mg/ml，进样各20 μl，按拟定色谱条件测定，记录峰面积值。以峰面积Y值为纵坐标，进样量X为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=5 342.2X + 1 960.5，r=0.999 6。结果表明绿原酸进样量在0.20～8.0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
       2.5  稳定性实验 准确称取同一批欧亚旋覆花，按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，并分别于0，4，8，12，18，24 h测定绿原酸峰面积，结果RSD为1.3%，表明样品在24 h内具有良好的稳定性。
       图1  绿原酸对照品色谱图（略）
       图2  欧亚旋覆花供试品色谱图（略）
       2.6  精密度实验 精密吸取对照品溶液20μl，连续进样5次，测定峰面积，RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。
       2.7  重复性实验精密称取同一批欧亚旋覆花药材共5份，约0.5 g/份，照“2.3”项下制备供试品溶液测定，测得其平均含量为1.52 mg/g ，RSD为1.8%，表明方法重复性良好。
       2.8  加样回收率实验 准确称取同一批欧亚旋覆花药材5份，约0.5 g/份，照“2.3”项下制备供试品溶液，测定，计算回收率。结果见表1。
       表1  欧亚旋覆花中绿原酸加样回收实验结果（略）
       2.9  样品含量测定  取7个不同产地的欧亚旋覆花，按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算含量。结果见表2。
       表2  欧亚旋覆花中绿原酸的含量测定结果（略）
       3  讨论
       
       结果表明，不同产地的欧亚旋覆花的绿原酸含量相差较大，最高的为1.52 mg/g，最低的为0.46 mg/g ，说明欧亚旋覆花中绿原酸的含量受产地、环境、气候和采集时间的影响较大。
       
       绿原酸对光较敏感，长时间光照易分解，因而实验中绿原酸对照品与样品均应采用棕色量瓶放置，保存10℃以下。稀释液不易长期保存，最好现用现配。
       
       本实验考察了不同提取方法（热回流、超声波震荡）、不同提取溶剂（50%甲醇、80%甲醇，甲醇，水）、不同提取时间(20，30，40 min)，结果表明，50%甲醇超声处理30 mim提取效率最高。
       
       绿原酸高效液相色谱法测定波长有327，330，325 nm等报道［10］。将绿原酸对照品溶液、供试品溶液分别注入液相色谱仪中，以二极管阵列检测器进行测定，得到它们的色谱扫描图及光谱吸收曲线。绿原酸对照品、欧亚旋覆花供试品所含绿原酸的光谱吸收曲线相一致，均在326 nm左右有最大吸收，故确定326nm为检测波长，供试品与绿原酸对照品在相应位置上有相似的吸收峰且分离度良好。
       
       本实验方法简便准确，为药材欧亚旋覆花的质量评价提供了依据，同时为其制剂方面的研究提供了借鉴。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：227.
       
       ［2］ 耿红梅，张嫡群，王云志，等.欧亚旋覆花中总黄酮的含量测定［J］.中草药，2006，37（3）：450.
       
       ［3］ Shao Y, Bai N, Zhou B. Kaurane glycosides from Inula Britannica［J］. Phytochemistry,1996,42(3): 783.
       
       ［4］ Park EJ, Kim Y, and Kim J. Acylated flavonol glycosides from the flower of Inula Britannica［J］.J Nat Prod,2000,63 (1):34.
       
       ［5］ 吴一兵，王云志，查建蓬，等.欧亚旋覆花中三萜和甾体化合物的分离和结构鉴定［J］.中草药，2006，37（5）：666.
       
       ［6］ 王云志，石晓伟，付 焱，等.1-O-乙酰大花旋覆花内酯对照品的制备及质量研究［J］.色谱，2005，23（6）：573.
       
       ［7］ 查建蓬，付 焱，吴一兵，等.欧亚旋覆花挥发油的GC-MS分析［J］.中药材，2005，28（6）：466.
       
       ［8］ 付 炎，郭 毅，张嫡群，等.欧亚旋覆花中多糖紫外光谱含量测定方法的研究［J］.中草药，2006，37（4）：544.
       
       ［9］ Kim SR, Park MJ. Flavonoids of Inula Britannica protect cultured cortical cells from necrotic cell death induced by glutamate［J］.Free Radical Biology & Medicine,2002,32(7):596.
       
       ［10］ 徐韧柳，李丽华，康怀萍.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量［J］.中国中医药信息杂志，2005，12（1）：53.