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       【摘要】 
       目的提取分离强心Ⅰ号方强心作用的有效部位。方法以大孔吸附树脂为分离材料，将强心Ⅰ号方组成药材的水提物、醇提物分别经蒸馏水，10%乙醇，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇，95%乙醇洗脱制得样品，然后通过离体蛙心试验观察受试样品的强心作用。结果水提物经30%乙醇，50%乙醇洗脱的样品和醇提物经30%乙醇，50%乙醇洗脱的样品对离体蛙心作用明显，其强心作用的半数有效浓度分别为：0.017g生药/ml，0.58 g生药/ml，10.11 g生药/ml，21.44 g生药/ml。结论强心Ⅰ号方中各味药材的水提物经30%乙醇，50%乙醇洗脱的样品和醇提物经30%乙醇，50%乙醇洗脱的样品具有明显强心作用。
       【关键词】  强心Ⅰ号方； 有效部位； 大孔树脂； 强心作用； 离体蛙心
       Extraction and Isolation of Effective Ingredients in Cardiac Ⅰ Compound
       HU Junna，JIA Jiming* ，WANG Hongtao， ZHAO Baohua， ZHENG Yajie，TANG Siwen，XU Dengfeng，ZHAO Shaohua
       （Hebei Normal University,Shijiazhuang  050016,China;Hebei Provincial Traditional Chinese Medicine and Western Medicine,Shijiazhuang  050035,China）
       Abstract：ObjectiveTo extract and isolate the effective ingredients in Cardiac Ⅰ compound.MethodsMacroporous absorption resin was used to isolate the water extract and the alcohol extract, and the extracts were prepared by distilled water, 10% alcohol, 30% alcohol, 50% alcohol, 70% alcohol, and 95% alcohol . Then the cardiac effect of the samples were observed by the experiment of the frog isolated heart.ResultsThe locus of water extract and alcohol extract in 30% alcohol and 50% alcohol had obvious effect on the frog isolated heart,and the locus of water extract in 30% alcohol had dose-effect relationship. The ED50 was 0.017g crude drugs/ml， 0.58 g crude drugs /ml，10.11 g crude drugs /ml，21.44 g crude drugs /ml,respectively.ConclusionThe locus of water extract and alcohol extract in 30% alcohol and 50% alcohol in  Cardiac Ⅰ Compound had obvious cardiac effect.
       Key words：Cardiac Ⅰ Compound;    The Utility Locus;    Macroporous absorption resin;    Cardiac effect;    Isolated heart
       
       随着人口老龄化与高血压病、冠心病治疗的进展，充血性心力衰竭(CHF)的发病率与死亡率不断上升，已成为心血管病的主要死因。预计在未来20～30年中其发病率将增长40%～60%［1］，心衰已成为全球最重要的公共卫生问题之一，防治心衰成为医学界亟待解决的难题。
       
       目前，药物仍然是治疗CHF的主要方法，寻找新的、更有效的抗心衰药物，具有重要的临床意义。应用现代科学技术与方法探讨中医药对CHF的治疗是当前临床与基础研究的一个重要方面。强心Ⅰ号方是由红参、葶苈子、红花等8味药材组成的复方制剂，研究显示强心Ⅰ号方对心力衰竭动物模型血流动力学指标有明显改善作用，其强心、利尿、扩血管作用对改善心衰症状具有临床价值,同时可明显降低血管紧张素Ⅱ，抑制醛固酮含量的增加，明显改善室壁厚度及心脏指数，显示其具有抑制心室重构作用，有助于改善慢性充血性心力衰竭结构及功能的生物学基础，符合复方中药标本兼治，多环节、多途径、多靶点治疗的综合优势。目前有关强心Ⅰ号方的药效物质基础的研究尚无报道，值得进一步研究。本课题从整体复方出发，结合方剂药物组成特点针对药效活性目标通过现代中药研究技术大孔吸附树脂、萃取等手段进行提取分离，结合药理实验模型重点对强心药效活性物质追踪研究，为进一步研究强心Ⅰ号方作用机理提供帮助。
       1  仪器与材料
       1.1  药材红参、葶苈子、红花、黄芪、丹参、玉竹、附子、泽泻等8味药材，由安国以岭饮片加工厂提供。
       1.2  动物健康牛蛙，300～400 g，500只，饲养在河北医科大学医药研究院药理实验室。
       1.3  仪器TNH-300提取浓缩机组；QN-300球形浓缩罐；GT6JA立、可倾式夹层锅；Y-ZG1000型真空干燥机，均由温州金榜轻工有限公司生产；中药提取罐，温州益坤机械制造公司；RE52-05旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；BL-420E+生物机能实验信号采集系统，成都泰盟科技有限公司。
       1.4  材料与试剂AB-8型大孔树脂，南开大学化工厂。任氏液；低钙任氏液（钙含量为正常任氏液的1/4）。
       2  方法与结果
       2.1  提取工艺
       2.1.1  乙醇提取工艺按照处方量分别称取其中红参、葶苈子、黄芪、泽泻4味药材，其中红参、葶苈子采用包煎。以上4味药材加70%乙醇8倍量，回流提取2次，3 h/次。合并提取液后减压浓缩至相对密度1.15～1.20（60℃），即得醇提物。
       2.1.2  水提工艺按照处方量分别称取丹参、红花等另外4味药材，其中红花包煎，最后放入，其余3味加蒸馏水8倍量，煎煮2次，2 h/次，过滤后合并煎煮液，减压浓缩至相对密度1.15～1.20（60℃），即得水提物。
       2.2  大孔吸附树脂分离
       2.2.1  大孔树脂的预处理和装柱称取45.0 kg AB-8型大孔树脂，以适量的95%乙醇浸泡24 h，分上两根树脂柱A柱、B柱。A柱用于醇提物的处理(12.0 kg），B柱用于水提物的处理（13.0 kg），再用95%乙醇反复洗脱，洗至洗脱液与水（1∶2）混合不产生混浊，至洗脱液无乙醇味，接着用2倍柱体积4%NaOH溶液清洗，然后用蒸馏水洗至pH中性（用pH试纸测定），并且树脂柱面不再下降时即可。
       2.2.2   醇提物的分离醇提物加蒸馏水稀释至质量体积分数为0.1 g药材/ml。以1BV（1倍柱体积，即12 kg的AB-8树脂折算体积为18l）的流速（即18 L/h，300 ml/min）通过树脂柱，上样完成后依次用4BV量（18×4=72 L）的蒸馏水及10%，30%，50%，70%和95%的乙醇进行洗脱，分别收集洗脱液。
       2.2.3  水提物的分离水提物加蒸馏水稀释至密度为0.1 g药材/ml。以1BV（1倍柱体积，即13 kg的AB-8树脂折算体积为20 L）的流速（即20 L/h，340 ml/min）通过树脂柱，上样完成后依次用4BV量（20×4=80 L）的蒸馏水及10%，30%，50%，70%和95%的乙醇进行洗脱，分别收集洗脱液。
       2.2.4  洗脱液的浓缩将不同浓度洗脱液分别用浓缩机组（30%，50%，70%，95%乙醇）、夹层锅（蒸馏水、10%乙醇）进行初步浓缩，然后在旋转蒸发仪中进一步浓缩至适当浓度。
       2.2.5  干燥及称量将不同乙醇浓度洗脱液，先在鼓风干燥箱中吹至呈浓浸膏状，在真空干燥机里进行减压干燥，干燥后称量各个洗脱部位的重量，计算出每克有效部位相当于的生药量(g/g)。
       2.3  离体蛙心实验
       2.3.1  离体蛙心预实验受试物参考24.8g生药剂量按1∶0.5的剂距设置剂量，将受试物溶解成合适浓度后，进行实验。
       
       实验方法：取制备好的离体蛙心［2～5］，打开BL-420E+生物机能实验信号采集系统，观察蛙心收缩曲线，待稳定后记录正常蛙心收缩曲线；将蛙心套管内任氏液换成低钙任氏液，在心脏收缩显著减弱时记录心衰模型蛙心收缩曲线；向蛙心套管内滴加受试物，对照组加等量任氏液，记录蛙心收缩曲线，以观察各样品是否有强心作用。
       2.3.2  离体蛙心半数有效浓度实验具有强心作用的样品分别配制成0.1，0.05，0.025，0.012 5，0.006 25，0.003 125g干粉/ml的浓度，按预实验方法进行实验，采集给药前后心脏最大收缩力，按以下公式计算强心率（QXL）：QXL＝（给药后最大收缩力－给药前最大收缩力）×100% /给药前最大收缩力。
       2.3.3   统计方法采用BLISS软件计算半数有效浓度。
       3  结果
       3.1  大孔树脂分离各部位
       3.1.1  醇提物经不同浓度洗脱液洗脱后所得到的有效部位见表1。
       表1  醇提物洗脱液洗脱所得有效部位（略）
       3.1.2  水提物经不同浓度洗脱液洗脱后所得到有效部位见表2。
       表2  水提物洗脱液洗脱所得有效部位（略）
       3.2  离体蛙心实验结果水提取部位有效性筛选结果：W1按0.08，0.04，0.03 g干粉/ml的浓度给予后，均出现心脏停跳的现象，以0.01 g干粉/ml的浓度给予后，心脏收缩力未见升高。W2按0.08 g干粉/ml（该浓度下样品未完全溶解）给予后， QXL为2.25%。W3以0.04 g干粉/ml给予后QXL为41.2%，W4以0.02 g干粉/ml给予后QXL为127.1%。W5，W6以0.04 g干粉/ml给予后心脏收缩力均未见升高。醇提取部位有效性筛选结果：E1以0.067 6，0.0169 g干粉/ml浓度给予后心脏均出现停跳现象，以0.00465g干粉/ml给予时QXL为61.75%，浓度为0.002 325 g干粉/ml时QXL降至45%。E2以0.05 g干粉/ml（该浓度下样品未完全溶解）给予后心脏收缩力均未见升高。E3以0.05 g干粉/ml给予后QXL为65.8%，而E4以0.05 g干粉/ml给予后QXL为89.9%。E5以0.06 g干粉/ml给予后QXL为102.8%，E6以0.135 4 g干粉/ml给予则心脏收缩力均未见升高。
       
       阳性对照药（去乙酰毛花苷注射液）给药后QXL则是21.4%。
       
       根据以上筛选结果可以确定，具有强心作用的有效部位是：W3，W4，E1，E3，E4，E5，将这些样品溶解成不同浓度进行实验，结果如下：W3，W4，E3，E4给药后心脏收缩力均明显升高，收缩力达最大值的时间在2 min左右。结果见表3。
       表3  W3，W4，E3，E4强心作用的半数有效浓度（略）
       根据各成分的含量W3，49.07 g生药/g干粉；W4，111.84 g生药/g干粉；E3，503.6 g生药/g干粉；E4，226.98 g生药/g干粉。折算为生药浓度：W3，0.017 g生药/ml；W4，0.58 g生药/ml；E3，10.11 g生药/ml；E4，21.44 g生药/ml
       
       E1均出现心脏收缩力先降低后升高的趋势，浓度为0.1g干粉/ml时降幅达60%， 然后再升高， QXL能达66.7%， 心脏最大收缩力出现平均时间为给药后10 min左右；以0.05 g干粉/ml的浓度给予后也出现心脏收缩力大幅度降低，再次升高后QXL为34.9%，心脏最大收缩力出现平均时间为给药后4 min左右；在浓度为0.025 g干粉/ml时则心脏收缩力未见升高。E5以0.1 g干粉/ml的浓度给予后心脏出现死亡，浓度降到0.05 g干粉/ml后，心脏收缩力大幅度降低，再次升高后QXL为20%。
       4  结论
       
       由药理实验结果可知提取部位W3，W4，E3，E4对离体蛙心心脏收缩力有增强作用，其强心作用的半数有效浓度分别为：W3，0.017 g生药/ml；W4，0.58 g生药/ml；E3，10.11 g生药/ml；E4，21.44 g生药/ml。
       
       实验依托成药的处方原制剂工艺，根据各个药材中具有强心作用的不同化学成分分别对几种药材选择进行水提、醇提［6～13］。在进行有效性筛选实验中，E1以0.067 6，0.016 9 g干粉/ml浓度给予后心脏均出现死亡现象，以0.004 65 g干粉/ml给予时QXL为61.75%，浓度为0.002 325 g干粉/ml时QXL降至45%；E5以0.06 g干粉/ml给予后QXL为102.8%；而在进行半数有效浓度实验时，E1，E5均出现心脏收缩力先降低后升高的趋势，当心脏收缩力降低时心脏长时间处于舒张期，室壁张力变大，当心脏再次收缩时需要的能量增加，而离体心脏的能量是一定的，故当心脏再次收缩时收缩力大幅度降低，甚至出现心脏死亡的现象，而E1，E5在两次实验中表现出的变化趋势和浓度都有所变化，推测其原因有2个，一方面是E1，E5中可能同时含有引起心脏收缩力增强和心脏收缩力降低的成分；另一方面，样品本身为粗提物，成分含量不均匀，两次取样时所取成分有所不同。为了进一步观察E1，E5样品中强心成分的作用，将这2个样品中的成分做最大程度的分离（可以考虑从浓度高低的角度来分离），然后再进行实验。本研究首次研究并确定抗心衰药物强心Ⅰ号方的有效成分，为进一步分离纯化的到其单一化合物开发出新的药物剂型及分离单一药物小剂型提供依据。
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