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       【摘要】 
       目的比较生姜油3个不同部位对四氯化碳(CCl4 )损伤培养的大鼠肝细胞的保护作用及可能作用机制。方法用大鼠制备含药血清。利用CCl4 体外诱导大鼠肝细胞损伤模型，用比色法检测肝细胞经含药血清处理后上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平的变化。结果生姜油Ａ 部位含药血清能显著降低ALT 和AST 水平，提高SOD 活力，抑制MDA 的产生；B 部位亦能显著降低ALT 和AST 水平，提高SOD 活力，但对MDA 未见有明显的影响；C部位仅能降低AST 水平，提高SOD 活力。结论生姜油3个不同部位的含药血清对CCl4 引起的大鼠肝细胞损伤均有不同程度的保护作用，但以A 部位的效果较好，其保护机制与其抗氧化作用有关。
       【关键词】  生姜油； 含药血清； 肝细胞损伤； 四氯化碳
       Comparison of the Protective Effects of Different Parts of Ginger Oil against Rat Hepatocytes in vitro 
       SHEN Hong, XUE Jie, ZHU Lujia，SUN Xiaofei,XIE Meilin*
       （The Medical Department of Huzhou Normal College，Huzhou 313000,China；Medical School of Soochow University, Suzhou 215123,China；School of Pharmacology,Medical School of Soochow University,Suzhou 215123,China）
       Abstract：ObjectiveTo compare the protective effects of three parts of ginger oil against rat hepatocyte injury induced by carbon tetrachloride (CCl4) and its mechanisms in vitro.  MethodsThe serum-drug of three parts of ginger oil was prepared with SD rats. The model of hepatocyte injury induced by CCl4 was used to examine the effects of serum-drug on the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in cultured supernatant.  ResultsPart A of ginger oil could significantly decrease the levels of ALT, AST and MDA, increase the activity of SOD.  Part B also significantly decreased the levels of ALT and AST, increased the activity of SOD. However it didn"t inhibit the production of MDA.  Part C only decreased the level of AST, increased the activity of SOD.  ConclusionThe three parts of ginger oil can prevent CCl4-induced hepatocyte injury in some degree, but the protective effect of part A is the best, and it is related to its antioxidation.
       Key words：Ginger oil;  Serum-drug;   Hepatocyte  injury;   Carbon tetrachloride
       
       生姜是一种常用的食品和调味品，也是临床常用的一味中药。现代药理研究证明，它具有抗氧化［1］、止吐［2］、防止血栓形成［3］、调节免疫［4］和降血脂［5］等多种作用。本课题组经在体实验发现，生姜油对CCl4 和扑热息痛引起的小鼠急性肝损伤均有一定的保护作用［6］。本文在此基础上，将生姜油用硅胶柱层析进一步分离，按极性的不同得到生姜油A、B 和C 3个部位，在体外观察和比较生姜油3个不同部位的含药血清对CCl4 损伤大鼠肝细胞的影响，从细胞水平探讨其保肝作用的有效部位及其可能机制。
       1  材料与方法
       1.1  动物和肝细胞　SD 雄性大鼠6只，体重（300±10）g，由苏州大学实验动物中心提供，清洁级，实验动物生产许可证号：XCYK（苏）2002-0008，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2002-0037。大鼠肝细胞株，购自中国科学院上海细胞生物学所。
       1.2  药品和试剂  生姜油A、B 、C 3个不同部位，A 部位主要为萜烯类，B 部位为姜油酮类，C 部位为姜酚类和姜烯酚类，由苏州大学孙晓飞教授提供；联苯双酯片，苏州第二制药厂生产。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA) 和超氧化物歧化酶( SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；四氯化碳，分析纯，南京化学试剂厂生产；二甲基亚砜购自Sigma公司；RPMI 1640 培养基为GIBCO 公司产品；新生牛血清为上海依科赛生物制品有限公司产品。
       1.3   仪器  二氧化碳培养箱，Heraeus公司产品；倒置显微镜XDS-1B型（重庆光学仪器厂）；722 型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）；TGL-16 G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；24孔细胞培养板为美国Corning公司产品。
       1.4   方法
       1.4.1  含药血清制备  雄性SD大鼠6只，4只大鼠分别以生姜油A、B、C 3个部位3.5 ml/kg和联苯双酯150 mg/kg每天分两次灌胃给药，其余2只大鼠给予等量的溶媒灌胃制备正常血清，第4天末次给药1 h后乙醚麻醉，腹主动脉取血，离心后取血清，经灭活除菌后分装，-20℃保存备用。
       1.4.2  CCl4肝损伤保护作用实验肝细胞悬液用细胞计数板计数并调节细胞数为1×106/ ml，接种于24孔板，每孔1 ml，置37℃，5%CO2培养箱中培养，12 h后，肝细胞全部贴壁生长，此时换液，改用含有10%含药血清或正常血清的培养基，然后除正常对照组外，其他各孔均加入终浓度为16 mmol/l的CCl4溶液（用终浓度不超过0.1%二甲基亚砜助溶），继续培养6 h后，离心取上清液用于测定ALT，AST，SOD，MDA，具体按试剂盒说明书进行操作。
       1.5  统计分析  实验数据以±s表示，显著性检验采用t检验。
       2  结果
       2.1  对CCl4肝细胞损伤后ALT和AST的影响CCl4 肝损模型组与正常对照组比较，模型组上清液中ALT 和AST 明显升高（P< 0. 01），表明CCl4 可使肝细胞严重受损。与模型组比较，生姜油A、B 两部位组上清液中ALT 分别下降了36.5%（P< 0. 01）和12.7%（P< 0. 05），C 部位组仅下降了7.8%，而联苯双酯组则下降了40.3%（P< 0. 01）。A、B、C 3个不同部位组间经两两比较，可见A 与B 部位组间、A 与C 部位组间均具有显著差异（P< 0. 01）；生姜油A、B、C 3部位组上清液中AST 分别下降了27.3%（P< 0. 01），12.3%（P< 0. 05）和17.6%（P< 0. 05），联苯双酯组则下降了36.9%（P< 0. 01）。生姜油A、B、C 3个不同部位组间经两两比较，仅见A 与B 部位组之间具有显著差异（P< 0. 05）。结果见表1。
       表1  生姜油不同部位含药血清对CCl4 损伤大鼠肝细胞培养上清液中ALT和AST的影响（略）
       与正常对照组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与A部位组比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；n=6
       2.2  对CCl4 肝细胞损伤后SOD和MDA 的影响CCl4 肝损模型组与正常对照组比较，模型组上清液中SOD 显著降低，MDA 明显升高（P< 0. 01）。各含药血清组与模型组比较，SOD 活性在生姜油A、B 部位组和联苯双酯组显著升高（P< 0. 01），生姜油C 部位组亦明显升高（P< 0. 05）。MDA 含量在生姜油A 部位组和联苯双酯组均显著降低（P< 0. 01），生姜油B 部位组虽有所降低但无统计学差异，生姜油C部位组则与模型组相似。生姜油A、B、C 3个不同部位组间经两两比较，SOD活性在A 与B 部位组间和A 与C 部位组间具有显著差异（P< 0. 01），MDA 含量仅见A 与C 部位组间具有显著差异（P< 0. 05）。结果见表2。
       3  讨论
       
       CCl4 引起肝损伤是一个经典的传统模型。一般认为，CCl4 进入肝细胞后, 被细胞色素P450 激活，经肝微粒体NADPH 依赖的电子传递系统代谢为三氯甲基自由基(·CCl3 ) 和三氯甲基过氧自由基(·OOCCl3 ) , 这两种自由基可掺入到微粒体膜的磷脂部分, 而启动脂质过氧化, 引起肝细胞的各种变化导致肝损伤［7］，培养细胞的上清液中ALT 和AST 水平的高低可以反映肝细胞损伤程度。本实验结果显示生姜油3个不同部位含药血清虽均能不同程度降低上清液中ALT 和AST 水平，但从总体来看， A 部位的作用最为明显，对肝细胞培养上清液中ALT 和AST 均有显著的降低作用，B 部位的作用次之，C 部位的作用相对较弱，仅能降低AST 水平，对ALT 的升高未见有明显的降低作用。组间比较也显示，B、C 部位含药血清对ALT 的降低作用均明显不如A 部位，对AST 的降低作用B 部位亦不如A 部位。这些研究结果表明生姜油3个部位对CCl4引起的肝细胞损伤均有一定的保护作用，其中以A 部位效果最好。
       表2  生姜油不同部位含药血清对CCl4 损伤大鼠肝细胞培养上清液中SOD和MDA的影响（略）
       与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与A部位组比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；n=6
       
       SOD 是细胞内主要的防御性抗氧化酶，能够清除自由基，并可抑制自由基启动的脂质过氧化反应，从而起到保护细胞膜结构与功能的作用，其活力的高低间接反映了机体清除自由基的能力。MDA 是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA) 引发脂质过氧化生成的一种脂质过氧化物，MDA 含量的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。已有文献报道，生姜油在体内外均有抑制氧化、清除自由基的作用［8，9］。本实验肝损模型组同正常组相比, 上清液中SOD 活性显著降低，MDA 含量显著增高，生姜油A 部位含药血清组SOD 活性较肝损模型组显著升高，MDA 含量显著降低；B，C 部位组仅见SOD活性较肝损模型组明显升高，MDA 含量虽有不同程度降低，但无统计学意义。组间比较显示，生姜油A 部位组提高SOD活性作用强于B 和C 部位组，降低MDA含量作用强于C 部位组。这些结果提示生姜油3个部位的抗氧化作用以A 部位效果最好。
       
       综上所述，生姜油3个不同部位含药血清在体外对CCl4引起的大鼠肝细胞损伤均有不同程度的保护作用，其中以A 部位效果较好，B 部位次之，C 部位较差，即A 部位的萜烯类保肝效果最好，其保肝作用机制部分与其抗氧化有关。
       【参考文献】
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