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       【摘要】 
       目的观察水蛭素对肝纤维化大鼠肝脏组织结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor, CTGF）mRNA表达的影响。方法SD大鼠60只随机分为空白对照组、模型组和水蛭素组共3组，每组20只，用40%四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）复制大鼠肝纤维化模型，水蛭素干预12周后处死大鼠，采用实时荧光定量PCR法检测大鼠肝组织CTGF mRNA的表达。结果模型组CTGF mRNA 2-ΔΔCt值（3.59±0.52）显著高于正常对照组（1.02±0.23）(P<0.05)，表明模型组CTGF mRNA表达上调。与模型组比较，水蛭素组CTGF mRNA 2-ΔΔCt值（1.83±0.34）显著降低（P<0.05），表明CTGF mRNA表达下调。结论水蛭素可能通过下调CTGF mRNA的表达，抑制肝脏细胞外基质异常增生发挥抗肝纤维化作用。
       【关键词】  水蛭素； 肝纤维化； 结缔组织生长因子； 实时荧光定量PCR
       Effect of Hirudin on the Expression of CTGF mRNA in Fibrotic Liver in Rats
       JIA Yan, NIU Yingcai*, ZHANG Yingbo,  ZHOU Li，DONG Miaoxian  
       （College of Basic Medical Sciences, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;Institute of Medicine, Qiqihaer Medical College, Qiqihaer 161042,China）
       Abstract：ObjectiveTo observe the effect of hirudin on CTGF mRNA expression in rat liver in hepatic fibrogenesis induced by carbon tetrachloride (CCl4). MethodsStudies were conducted in 60 male Sprague-Dawley rats, and they were equally randomly divided into 3 groups with 20 in each, named as blank controls group, model group, and hirudin group. A hepatic fibrosis model on rats was set up with CCl4(40%). Hirudin were given to the hirudin group fibrotic rats (daily gavage), normal saline was given to the control group and model group rats. After 12 weeks, CTGF mRNA expression in hepatic tissue were detected by real-time quantitative reverse transcription-PCR. Results The CTGF mRNA expression was up-regulated In model groups, in which CTGF mRNA 2-ΔΔCt value were 3.59±0.52 , compared with the blank group (1.02±0.23，P<0.05). The CTGF mRNA expression in hirudin group (1.83±0.34) was down-regulated compared with the model group(P<0.05).ConclusionHirudin may down-regulate expression of CTGF mRNA and Inhibit the abnormal hyperplasia of hepatic extracellular matrix, so it has the function of antihepaticfibrosis.
       Key words：Hirudin;   Hepatic fibrosis;   Connective tissue growth factor;   Real-time quantitative reverse transcription-PCR
       
       肝纤维化是大多数慢性肝病向肝硬化发展的共同病理过程，成因相当复杂，阻断肝纤维化的继续发展，是预防肝硬化的关键［1］。肝纤维化的特征是肝细胞增殖和细胞外基质聚集，并需转化生长因子-β1（TGF-β1）参与，CTGF是TGF-β1的下游效应介质，具有介导TGF-β1促细胞外基质沉积的作用，阻断CTGF可抑制TGF-β介导的细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）产生［2］。多数中医医家认为肝血瘀阻是肝纤维化基本病机，因此用药以活血化瘀为主。水蛭是经典的破血逐瘀类中药。作者利用SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR技术，建立大鼠肝组织CTGF基因相对表达量的检测方法，观察了水蛭素干预对CCl4诱导的大鼠肝纤维化肝脏组织中的CTGF基因的影响。
       1  材料与仪器
       1.1  药物 水蛭素的提取［3］：先将宽体金线蛭干制品粉碎，然后加入10倍体积的80%预冷丙酮，4℃搅拌10 min，再加入氯化钠和三氯乙酸，搅拌30 min，然后离心，弃上清液，沉淀中加入其体积1/3的80%冷丙酮，抽提2次，离心，收集上清液，合并两次抽提液加入2倍体积的冷丙酮，静置2h，再离心，弃上清液，收集沉淀，干燥得水蛭素粗品。四氯化碳（CCl4分析纯）：北京北化精细化学品有限责任公司。
       1.2   动物及分组 选用健康雄性清洁级SD大鼠60只，体重（200±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号SCXK（京）2002-0003。经适应性饲养1周，随机分为空白对照组、模型对照组和水蛭素组共3组。
       1.3   试剂和仪器SYBR ExScriptTMRT-PCR kit（Perfect Real Time）为TAKARA公司产品，2700型PCR System扩增仪为Applied Biosystems公司产品，UV-2550型紫外分光光度计为日本岛津产品，ABI 7300荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。
       2   方法
       2.1   肝纤维化模型的建立［4］和药物干预 大鼠皮下注射体积比为40%的CCl4和橄榄油混合液0.2 ml/100 g，每周2次，连续12周。正常组用等量生理盐水皮下注射，水蛭素组在造模同时按60mg·kg-1，1次/d，灌胃给药，连续12周，正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，治疗结束后第2天，剖取动物肝脏。
       2.2   荧光实时定量PCR检测大鼠肝脏组织CTGF mRNA表达
       2.2.1  抽提总RNA 实验结束时（12周末）在戊巴比妥钠麻醉条件下随机每组取5只大鼠处死，取肝脏组织100mg，用RNAiso Reagent（TaKaRa公司）提取总RNA，按RNAiso Reagent操作说明书进行。提取的RNA质量由OD260/OD280比值和2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
       2.2.2  引物序列 CTGF引物序列: forward，5′-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3′；reverse, 5′-AGCCCGGTAGGTCTTCACACTG-3′。GAPDH引物序列：forward，5′- GACAACTTTGGCATCGTGGA-3′；reverse，5′- ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。
       2.2.3   逆转录反应 在2700型PCR System扩增仪上按SYBRExScriptTMRT-PCR Kit反转录试剂说明书进行cDNA的合成，反应参数为：反转录反应42℃ 15 min，反转录酶的失活反应95℃ 2 min。
       2.2.4   PCR反应 PCR反应采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time) kit试剂，在ABI 7300荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上进行PCR反应。设置检测文件，反应条件如下：第一步是预变性，95℃预变性10 s，共1个循环。第二步是PCR反应，95℃变性5 s，60℃退火31 s，共40个循环。整个过程中收集荧光，反应结束后，使用Sequence Detection software version 1.2.3软件（Applied Biosystems公司）分析PCR过程各检测样本的Ct（Threshold cycle）值，Ct值随模板浓度增大而减少。由熔解曲线判断PCR反应的特异性。
       2.3   统计方法 计量资料用±s表示，用SPSS13.0统计软件进行分析。多组间差异的显著性分析用单因素方差分析，组间两两比较用SNK检验。
       3  结果
       3.1   产物鉴定 实时定量PCR产物2%凝胶电泳图见图1。
       图1   2%凝胶电泳图分析real time PCR扩增产物（略）
       
       各产物的熔解曲线仅有1个峰，说明为单一片段扩增，熔解温度分别为GAPDH 86.9℃，CTGF84.8℃。扩增产物经2%琼脂糖电泳，紫外线下扫描分析，GAPDH为120～150bp，CTGF为180-200bp。符合设计的片断长度。
       3.2  扩增效率分析［5］将一只大鼠肝脏组织的RNA反转录成cDNA并以2倍梯度稀释，相对浓度为1，0.5，0.25，0.125，以其为实时荧光定量PCR扩增模板，实验中每样本均做2个复孔。另加3个无模板的阴性对照，所有计算采用每个样本所得的平均循环数值，且样本复孔的Ct值之间差异小于1个循环。以GAPDH和CTGF的Ct值与对应的相对浓度对数值作图（图2），GAPDH和CTGF对应的直线相关系数R2分别为0.998 2和0.999 8，斜率分别为为-3.2791和-3.2525，扩增效率根据E=10(-1/alope)计算，EGAPDH为2.0182，ECTGF为2.0298。结果表明GAPDH和CTGF扩增效率一致，2-ΔΔCt相对定量方法适合于本试验。
       3.3  水蛭素肝纤维化大鼠肝脏组织CTGF mRNA表达的影响 结果见图3和表1。分别扩增GAPGH和CTGF，每样本作2复孔，得到两组Ct平均值。△Ct干预组=Ct干预组CTGF-Ct干预组GAPDH，△Ct空白组=Ct空白组CTGF-Ct空白组GAPDH，△△Ct=△Ct 干预组-△Ct空白组，CTGF mRNA表达差别倍数以2-△△Ct表示。
       图2  GAPDH和CTGF扩增效率计算图（略）
       图3  各组样本CTGF mRNA的扩增曲线（略）
       表1  各组大鼠肝脏组织CTGF基因表达相对值比较（略）
       空白对照组比较：*P＜0.05；与模型对照组比较：#P＜0.05；n=5
       4  讨论
       
       在我国肝纤维化是一种常见病症，该病变的继续发展将导致肝硬化，甚至可能发生癌变，因此，寻找一种安全有效的药物是其防治的当务之急，从传统中药中寻找抗肝纤维化的活性物质越来越受人们的关注［6］。肝纤维化属中医“积聚”范畴，在临床虽然可表现为各种不同证候，但血瘀证几乎伴随着其整个病程，肝络瘀阻是病变发展的重要病理环节，常伴有局部或全身的血液循环障碍［7］。水蛭素是存在于水蛭唾液中的一种酸性多肽类物质，由于重组水蛭素C端63位的Tyr不能像天然产品那样被硫酸酯化从而严重影响了其生物活性，因此提取天然水蛭素更具有临床应用的价值［8］。我们经过丙酮、三氯乙酸的沉淀和抽提除去水蛭所含的脂肪、核酸和大量杂蛋白，得到水蛭素并观察其对实验性肝纤维化大鼠肝脏组织CTGF mRNA表达的影响。
       
       CTGF是一种C端富含半胱氨酸的分泌多肽，属即刻早期基因CCN家族，是一重要的促组织纤维化蛋白，具有有丝分裂原效应，促进血管平滑肌等细胞增殖；在其他细胞因子的协同作用下刺激细胞外基质的合成，抑制其降解，导致ECM的聚集及结构改建，表达细胞粘附分子。TGFβ是导致组织纤维化形成的最重要的细胞因子之一，CTGF为其下游效应介质，TGF-β作用于CTGF的启动子区域刺激CTGF的合成分泌，CTGF则通过直接作用星状胶质细胞和结缔组织刺激细胞外基质的分泌介导TGF-β致纤维化的作用［9］。TGFβ作用复杂，单纯抑制其活性可能引起许多难以预料的副作用。而CTGF作为它的下游效应介质，作用较单一，在正常状态下表达水平很低，因此成为治疗肝纤维化有效靶点。
       
       实时荧光定量PCR是近年发展起来的基因定量方法，具有准确、敏感和简便等特点。检测基因表达变化有绝对定量和相对定量两种方法，在本研究中，我们关注的不是CTGF基因的拷贝数，而是它在水蛭素干预后基因表达的改变情况，所以我们采用相对定量方法2-ΔΔCt法，并引入看家基因GAPH作参照。本实验结果显示，肝纤维化模型组大鼠肝组织CTGF mRNA表达较正常组明显增加（P<0.05），而水蛭素干预可使肝纤维化模型大鼠肝组织CTGF mRNA表达水平下调（P<0.05），提示水蛭素可能通过下调CTGF mRNA转录而实现抗肝纤维化作用。
       【参考文献】
         　　［1］ 刘克洲，侯 伟. 肝纤维化的治疗策略［J］. 中国中西医结合杂志，2006，26（1）：8.
       
       ［2］ Qi W, Chen X, Twigg S, et al. Tranilast attenuates connective tissue growth factor-induced extracellular matrix accumulation in renal cells［J］. Kidney Int. 2006, 69(6): 989.
       
       ［3］ 陈 曦，刘光明，胡 强，等. 天然水蛭素的提取和纯化［J］. 华东师范大学学报（自然科学版），2004，2：104.
       
       ［4］ 刘 莺，刘 平，胡义扬，等. 纤维化大鼠肝组织与物质代谢相关蛋白质动态变化及扶正化瘀方的调节作用［J］. 中国中西医结合杂志，2006，26（3）：224.
       
       ［5］ Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 ［-Delta Delta C(T)］Method［J］. Methods. 2001,25(4): 402.
       
       ［6］ Lee TY, Chang HH, Chen JH, et al. Herb medicine Yin-Chen-Hao-Tang ameliorates hepatic fibrosis in bile duct ligation rats［J］. J Ethnopharmacol. 2007, 109(2): 318.
       
       ［7］ 张 斌，王中华，王江蓉，等. 血瘀型肝纤维化大鼠模型的建立与评价［J］. 中国中医基础医学杂志，2006，12（11）：836.
       
       ［8］ 张 颖，冯加纯，吴 江，等. 水蛭素对大鼠实验性脑出血急性期保护作用的研究［J］. 中国中药杂志，2006，31（1）：69.
       
       ［9］ Sun K, Wang Q, Huang XH. PPAR gamma inhibits growth of rat hepatic stellate cells and TGF beta-induced connective tissue growth factor expression［J］. Acta Pharmacol Sin. 2006, 27(6): 715.