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       【摘要】 
       目的应用膜片钳技术研究HEK细胞Nav1.5电流电压依赖性Na+电流失活与激活曲线, 甘松挥发油对电流-电压关系(I-V)，电导-电压关系(G-V)曲线的影响, 以及对快Na+通道失活(H-I)的影响。方法应用膜片钳技术研究HEK细胞Nav1.5电压依赖性Na+电流失活曲线, IV和HI曲线。结果正常自然依赖性失活曲线向超极化移位，移动速度10 min内是4 mV。甘松挥发油能降低I－V曲线Na电流的峰电位，但不能改变其Na电位（ENa）从内流向外流的反转电位的方向。GV曲线明显向超极化方面移动，Vg1/2 =(-59.8±4.22) mV是对照自然失活曲线；Vg1/2 =(-58.8±5.69) mV 是10 PPM甘松挥发油；Vg1/2 =(-68.0±4.36) mV是药物被洗脱后失活曲线（P＜0.01，n=6）。在除去自然移动值后10 PPM甘松挥发油的Na电位失活作用明显。甘松挥发油应用前, 应用10 PPM甘松挥发油以及药物洗脱后H－I曲线与自然失活曲线比较，校正自然失活因素后10 PPM甘松挥发油实际移动Vg1/2是(18.0±4.50) mV (P<0.01, n=5)，洗脱40 min后接近对照状态。结论甘松挥发油对IV，GV曲线有向超极化移位的影响。对快Na+通道有加速失活与抑制激活的作用, 然而电压依赖性Na失活是可逆性的。这一作用奠定了甘松挥发油抗心律失常的作用机制。
       【关键词】  甘松挥发油； HEK细胞； Nav1.5； 膜片钳
       The Effects of the Volatile Oil of Nardostachy chinesis Batal on Na+ Current of the Cardiac Sodium Channels of Rats and Nav1.5 in HEK Cells
       GE Yuzhi ，WU Zhiting，HU Langji，Jay Z Yeh
       （Jiangxi Provincial People"s Hospital, Jiangxi Cardiovascular Disease Research Institute, Nanchang, 330006, China; Northwestern Medical University, Chicago IL USA 60611）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of traditional Chinese medicine volatile oil of Nardostachy Chinesis Batal (TCMVONCB) on the curves of current-voltage relationship(I-V)，conductance-voltage relationship (G-V) and fast Na channel inactivation (H-I) of voltage-dependent in Nav1.5 channels in human embryonic kidney (HEK) cells.MethodsThe whole-cell patch-clamp technique and HEK cells were employed to research the effects of TCMVONCB on the curves of I-V，G-V and H-I of voltage-dependent current in Nav1.5 channels.ResultsTCMVONCB reduced the peak of Na current in the I-V curve, but could change its Na (ENa) reversal potential direction from within flows to outside　G-V curve move to the hyper-polarization, Vg1/2 =(-59.8±4.22)mV was control curve; Vg1/2 =(-58.8 ± 5.69)mV was 10 PPM  TCMVONCB curve; Vg1/2 =(-68.0 ± 4.36)mV was for wash out curve (P<0.01, n=6). 10 ppm TCMVONCB has significant effects on the current of Nav1.5 after removing the natural movement in the value, the Vg1/2 after 10 pmm TCMVONCB was Vg1/2 =18.04.5 mV (P<0.01, n=5)comparing the control, after 40 min of wash out, the value of Vg1/2 remove back and close to the state of control. ConclusionTCMVONCB has the effects of hyper-polarizing shift on the curves of I-V and G-V and Na channel to accelerate faster deactivation and inhibit activation, but voltage-dependent Na inactivation is reversible. This role is basic anti-arrhythmic mechanisms for the TCMVONCB.
       Key words： Volatile oil of Nardostachy Chinesis Batal；   Nav1.5；    Whole-cell；   Patch-clamp HEK cells
       
       实验与临床证明，目前被广泛使用的抗心律失常中成药（稳心颗粒等）中的主要有效成分甘松具有良好的抗心律失常作用［1～3］。以往一般电生理研究方法发现，甘松乙醇或水的提取液具有拮抗氯化钡诱发大鼠心律失常的作用，对氯仿和肾上腺素诱发的家兔心律失常也有拮抗作用，并能延长家兔离体心房的不应期。然而，其确切的细胞电生理、电药理机制及药物直接作用靶点尚不清楚［1,3］。为今后进一步对甘松有效成分挥发油深入研究, 本实验除应用膜片钳技术和大鼠心肌细胞外还应用HEK细胞Nav1.5, 这种细胞是利用大鼠cDNA密码编程心肌钠通道密码子序列，在人体肾胚胎细胞上表达而产生的一种新型克隆细胞(human embryonic kidney，HEK)［4～6］。克隆的HEK细胞Nav1.5心肌纯钠通道不但使得膜片钳实验中操作的难度大大降低，还使得实验得出的结果更准确，大大促进了该领域的研究工作。本实验在应用细胞膜片钳技术对Nav1.5单纯钠通道的研究，通过I-V和H-I曲线的测定及电压依赖性等实验，探索甘松挥发油抗心律失常作用的靶点及其详细的细胞电生理、电药理的机制，同时也为今后深入研究奠定基础。
       1  材料与方法
       1.1  甘松挥发油提取及稀释参照已报道的方法［7］，称取阴干后的甘松样品，按《中国药典》（Ⅰ部）甲法进行水蒸馏，经6 h后停止加热，静置过夜，油水相分离后得浅绿色油状液体。用双向溶剂二甲基亚砜，按比例进行稀释。
       1.2  HEK细胞Nav1.5用鼠cDNA编码组成的纯钠通道在人胚胎肾细胞（HEK）上表达而致的一种仅有纯钠通道的细胞 ，由美国西北大学药理分子生物学系 Yeh Jay Z.教授提供。
       1.3  全细胞膜片钳记录
       1.3.1  膜片钳记录使用的仪器与设备膜片钳放大器Axon/USA(Axopatch 200B mplifier/pClamp9/Digidata pack1322A），精密微操纵器SD/USA(MX7600/R Motorized Manipulator/MC 1000e Controller/Amplifier headstage mount)，荧光倒置显微镜，03-D型玻璃微电极拉制仪，MPS多通道快速微量加药系统，入水阻抗为1～2MO。
       1.3.2  膜片钳记录程序与方法数控恒温槽在电压钳制模式下，根据钳制电位的不同，分别测量Na+离子通道电流。当阻抗达到1GO以上，补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式，调节慢电容补偿和串联电阻补偿以减少瞬时充放电流和钳制电位误差。膜片钳放大器与计算机相连，信号发放和采集均由软件完成并存储在硬盘内，供测量和分析用。
       1.3.3  膜片钳记录溶液与试剂正常台氏液成分：NaCl 140 mM；KCl 5.4  mM；CaCl2 1.8 mM； MgCl2 0.5 mM；HEPES 5.0 mM；Dextrose 5.5 mM；NaH2PO4 0.4 mM；pH用NaOH调至7.40。无钙台氏液(MITRA/MORAD为正常台氏液中不加CaCl2)；NaCl 135 mM；KCl 5.4 mM；MgCl2 1.0Mm；HEPES 10mM；Detrose 11 mM；NaH2PO4 0.33 mM；pH用NaOH调至7.30。记录外部溶液(External Solution)：NaCl 25 mM；MgCl2 1.2 mM；HEPES 20 mM；D-glucose 11 mM；CsCl 5mM；CoCl2 1.0 mM；Tetramethylammonium chloride 115mM。记录内部溶液（Internal Solution）：CsF 145 mM；NaF 5.6 mM；HEPES 5 mM； 用CsOH 1 M 调pH至7.2±0.02。
       2  结果
       2.1  正常随时间电压依赖性失活S曲线向超极化移位，从回归线上表明，移动速度10 min内是4 mV，这一正常对照自然失活，在计算甘松挥发油时予应以考虑和扣除（图1）。
       图1  电压依赖性Na+电位失活与激活曲线具有自然时间依赖性失活移动（略）
       
       顶部小图a 描述了应用一对双脉冲刺激诱发Na+电流激活与失活曲线，刺激程序为每150 ms从钳置电位-140，-80到0 mV，步长-10 mV，取10 min时间点绘图。图b. 则从钳置电位-140，-100，0 mV步长-10 mV，取40 min时间点绘图。图A：以钳置电位-140的函数标化为1着点绘图，这种稳定的快钠失活以中点和斜率为特点的“S”曲线。曲线在一个时间常数向超极化方向移动。图B：以中间点时间为函数（实心圈），从每10 min 4mV作一回归线。尽管在中点发生移动, 但斜率围绕7.0 mve-fold维持不变，同样类似变化也发生在电压依赖性激活的中点（V1/2）见图B.空心圈。
       2.2  甘松挥发油能降低Na电流的峰电位，但不能改变其Na电位（ENa）从内流向外流的反转电位的方向。本文Na峰电位的降低是通过电压依赖性对除极反应的导电增加来评价。钠电导（GNa）是通过Em除以峰电流获得，INa则通过Em-ENa求得。所得结果按半对数绘表而取得电流-电压(I-V) 关系, 电导-电压关系（G-V）（见图2）
       
       G－V曲线明显向超极化方面移动，Vg1/2 =(-59.8±4.22) mV是对照自然失活曲线； Vg1/2 =(-58.8±5.69) mV 是10 PPM甘松挥发油；Vg1/2 =(-68.0±4.36 ) mV是药物被洗脱后（P＜0.01，n=6）。在图2C.小插图上显示了在药物被洗脱后，Vg1/2返回到自然移动的预期值，因此，在除去自然移动值后，插图可见10 PPM甘松挥发油的作用明显（实心方形是10 PPM，空心是对照）。
       图2  甘松挥发油对I-V，G-V曲线的影响（略）
       
       图A：为一原始I-V曲线电流图，15 ms除极脉冲从-100到+60mV，步长为10mV，钳置电位为-140mV。图B：显示电流-电压（I-V）关系曲线，记录Na电流峰电位(I Na)按除极每步功能作点（Em）计算点作I-V曲线。  图C：10 PPM 甘松挥发油不能改变7 mV对照反转电位(ENa)。 按GNa=INa/(Em-ENa)公式计算, 按电压功能电导数据(Em)绘制对数表，以获得电导-电压（G-V）关系。从G-V曲线中点电位(Vg1/2)看, 在10 min , 20 min, 及30 min冲洗后, 电位分别是: -60mV, -56.4 mV, -67mV。 斜率是 5, 8, 5.2 mV/e-fold 钠导增加。图2 C是对照自然时间移动所显示Vg1/2改变。
       2.3  应用甘松挥发油应用前, 应用10 PPM甘松挥发油以及药物洗脱后与自然失活曲线比较(图3B)，校正自然失活因素后10 PPM甘松挥发油实际移动Vg1/2是(18.0±4.50) mv(n=5)，洗脱40  min后能接近对照状态，因此甘松挥发油电压依赖性Na失活是可逆性的。
       图3  甘松挥发油对快Na+通道失活的影响与自然时间依赖性失活对比（略）
       
       图A：原始快Na通道失活图（H-I曲线图），由除极脉冲-140 mV到0 mV，步长10 mV。图B：按方程 Itest /Imax = 1/{1 + exp［(V-V1/2)/k］}, 参数V1/2=-83 mV, k=7为对照资料（空心圈表示），参数V1/2=-110 mV, k=7为10 ppm甘松挥发油资料（实心三角形表示），参数V1/2=-102 mV, k=7.5为洗脱后10 min（空心方块形表示）。图C：甘松挥发油对V1/2改变（实心圈）的影响与对照自然时间依赖性失活曲线比较（空心圈）。
       3  讨论
       
       影响离子通道的各种药物的药理机制很大程度上是借助于膜片钳技术进行实验而直接得到结果的［4～6, 8～10］, 心肌细胞存在多种离子通道, 要研究单纯某种离子通道的作用和影响，就得借助一些药物或化学的方法去阻断其他的离子通道，有时这些方法存在阻断不完全以及阻断剂本身对细胞的正常生理代谢带来影响, 其结果准确度尚存争议［4～6］。HEK Nav1.5是指用鼠cDNA编码组成的纯钠通道在人胚胎肾细胞上表达而致的一种仅有钠通道的细胞，该种细胞是当前国际上流行使用研究钠通道的细胞，以代替以往通常使用的动物分离心肌细胞［4～6］。 HEK Nav1.5细胞的使用是膜片钳技术与分子生物学基因重组技术的结合，为准确研究一些抗心律失常药的确切电生理机制和开发新药提供了新的可靠方法［4～6］。I-V和H-I曲线试验不同药物浓度在衡定作用下，测定不同电压钳置状态下激活与失活钠通道的能力。I-V曲线主要通过药物对离子电流抑制稳定在50%左右水平，此时逐渐增加电压钳置的数值，得出离子电流通道改变对应值的曲线图，检测通道激活的能力，即：在曲线图上找出电压钳置在什么数值水平时通道开放最多。H-I曲线主要通过对不同电压钳置状态下，离子通道开放的电流百分比来测定离子通道的失活性［4～8］。
       
       根据以往的资料和本实验证实电压依赖性Na+电位失活与激活曲线具有自然时间依赖性失活移动，这种稳定的快钠失活以中点和斜率为特点的“S”曲线。曲线在一个时间常数向超极化方向移动。这一特性对测定每种药物对Na+电位失活与激活曲线具有十分重要意义, 然后根据用药前后该数值的变化作出的曲线，来判断药物对曲线移动的影响，在除去自然时间依赖性失活曲线移动的因素影响下比较用药前后该数值的变化作出的曲线,才具有实际意义。曲线左移为离子通道失活加强，反之则失活减弱。试验发现I-V和H-I曲线，正常自然依赖性失活曲线向超极化移位，移动速度10 min内是4 mV。甘松挥发油能降低I－V曲线Na电流的峰电位，但不能改变其Na电位（ENa）从内流向外流的反转电位的方向。G－V曲线明显向超极化方面移动。在除去自然移动值后10 PPM甘松挥发油的作用明显。应用甘松挥发油应用前, 后及药物洗脱后H－I曲线与自然失活曲线比较，校正自然失活因素后10 PPM甘松挥发油实际移动Vg1/2是(18.0±4.50) mV，洗脱40 min后接近对照状态。发现对快Na+通道加速失活与抑制激活的作用, 这一作用奠定了甘松挥发油抗心律失常的作用机制。
       
       近来研究发现甘松挥发油具有甘松有效浓缩成分主要含单体成分：卡拉稀(Calarene占29.44%)、△1(10)-土青木香烯酮-2(△1(10)-Aristolenone-2占16.57%)及甘松醇(Jatamansinol占8.8%)［7］，约占所有化学成分的60%。该研究对将来进一步开发甘松挥发油单件抗心律失常制剂具有实际的意义。
       【参考文献】
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