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       【摘要】 
       目的制备羟基喜树碱的半固体脂质纳米粒(HCPT-SSLN)。方法在单因素考察的基础上，通过正交设计优选处方和制备工艺，并对优化条件下制备的HCPT-SSLN纳米溶液进行质量评价。结果制备的HCPT-SSLN平均粒径为130.5 nm，多分散系数为0.18，载药量为2.51％，包封率为79.19％，ξ电位为-33.1mV；纳米溶液4℃下放置6个月，纳米粒外观、粒径及包封率无明显变化。结论所制备的HCPT-SSLN包封率和载药量较高，粒径分布均匀，稳定性良好，为羟基喜树碱的临床应用提供了更广阔的前景。
       【关键词】  羟基喜树碱； 半固体脂质纳米粒； 制备工艺
       Study on the Preparation Technology of Hydroxycamptothecin Semisolid Lipid Nanoparticles
       XI Na，HOU Lianbing，XI Chuanpo
       （Department of Pharmacology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong Guangzhou 510515, China;Outpatient clinic,Artillery Direction Institute of PLA,Anhui Hefei 230031,China）
       Abstract：ObjectiveTo prepare hydroxycamptothecin semisolid lipid nanoparticles (HCPT-SSLN). MethodsBased on the single-factor experiment, the HCPT-SSLN was prepared by orthogonal design for optimization of formulation and technology. Then the obtained SSLN was evaluated. ResultsThe mean particle size of the prepared HCPT-SSLN was 130.5nm, Polydispersity index(PI) was 0.18, drug loading(DL) was 2.51％, entrapment efficiency(EE) was 79.19％, ξ potential was -33.1mV; Placed at 4℃ for 6 months, the appearance, particle size and entrapment efficiency of SSLN were all stable.ConclusionThe HCPT-SSLN has high entrapment efficiency and drug loading, uniform particle size, good stability, which provides an extensive prospect for clinical application of HCPT.
       Key words：Hydroxycamptothecin;   Semisolid lipid nanoparticles(SSLN);   Preparation
         
       纳米粒载药系统自1976年由Birrenbach首次报道以来，由于其具有可生物降解、低免疫性、有一定靶向性且制剂形式多样化等优点，至今已取得很大发展［1］。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是粒径为50～1000nm的新一代亚微粒给药系统［2］，它能将药物包裹于类脂核中而使药物稳定性增加，并具有缓控释、靶向、低毒等优点。羟基喜树碱(hydroxycamptothecin, HCPT)是拓扑异构酶Ⅰ(TOPO-Ⅰ)抑制剂［3～5］。它抗瘤谱广，且无交叉耐药性，目前已作为临床一线用药。但因其特殊的理化性质：水不溶脂难溶、内酯环结构不稳定等因素，使得目前临床应用受到了限制［6］。本研究在单因素考察的基础上，通过正交设计优选处方和制备工艺，以固体脂质和液体脂质混合物为载体材料制备HCPT的半固体脂质纳米粒(semisolid lipid nanoparticles, SSLN)，并对优化条件下制备的HCPT-SSLN纳米溶液进行了质量评价。
       1    仪器与试剂
       
       UNICAM UV500紫外分光光度计(英国Thermo Spectronic公司)；激光粒度仪-3000HS(英国Malvern Instruments Ltd)；冷冻干燥机(LABCONCO FreeZone 12L)；JEM-2010透射电子显微镜(TEM)(日本株式电子会社)；TMP-1型电子天平（德国Sartorius公司）。
       
       10-羟基喜树碱原料药(含量98％，四川广汉市生化制品有限公司)；Palmitic acid(十六酸，汕头市西陇化工厂)；Dynasan 118(三硬脂酸甘油酯，Sasol)；Corn oil(玉米油，Sigma)；注射用大豆卵磷脂(上海太伟药业有限公司)；Solutol HS 15(聚乙二醇15羟基硬脂酸醋，BASF)；Cremophor EL(氢化蓖麻油，BASF)；PEG-8-辛酸癸酸甘油酯(GATTEFOSSE)；辛酸/癸酸三甘油酯(浙江兰溪物美化工有限公司)；泊洛沙姆188(Sigma)；卖泽Myrj 59、苄泽Brij 53(Sigma)，其它试剂均为分析纯；双蒸水用前经0.45μm微孔滤膜过滤。
       2   方法
       2.1    HCPT-SSLN的制备采用乳化蒸发-冷却固化法制备HCPT-SSLN。称取一定量的HCPT、脂质、卵磷脂共溶于适量有机溶剂中制得有机相，另称取适量表面活性剂溶于水中制得水相，在75℃水浴下，将有机相匀速注入水相中，避光恒温搅拌，挥干有机溶剂并浓缩至一定体积，将此半透明乳液快速分散于适量0℃冰水中继续搅拌固化0.5 h，经0.8 μm微孔滤膜过滤，即得HCPT-SSLN。以纳米粒的外观、粒径、包封率为考察指标，分别考察了有机溶剂种类、有机相种类、表面活性剂种类、固态脂质/液态脂质摩尔比、药脂比、有机溶剂用量、表面活性剂浓度、水相与油相中表面活性剂比例、乳化过程中水相与油相比例、有机相注入水相速度、乳化蒸发搅拌时间、搅拌速度等单因素的影响。
       2.2    正交设计优化HCPT-SSLN的制备工艺在单因素实验考察的基础上，选择药脂比(A)、固态脂质与液态脂质的摩尔比(B)、表面活性剂浓度(C)3个因素，每个因素选择3个水平，按正交设计表L9（34）实验。以包封率为指标，按正交结果拟定的最佳处方和工艺制备3批样品，对制得的HCPT-SSLN进行质量评价来对优化结果进行验证。
       2.3  HCPT-SSLN冻干粉的制备按2 ml/瓶将HCPT-SSLN分装在7 ml的西林瓶中，每瓶中加入4.0%的乳糖，搅拌使完全溶解，放入冷冻干燥机，按照0.5℃/min降温至-34℃并维持24 h，在冷凝器低温、干燥箱保持一定真空度条件下，按照0.07，0.04，0.07℃/min三阶段升温至25℃，保温10 h，取出样品，压盖处理，即得HCPT-SSLN冻干粉剂。
       2.4  HCPT-SSLN纳米溶液的质量评价
       2.4.1    形态、粒径分布和ξ电位测定取HCPT-SSLN适量，稀释，滴加在覆盖碳膜的铜网上，室温(25℃)下以2.0%的磷钨酸钠液负染，透射电镜下观察粒径大小和形态。
       
       取HCPT-SSLN适量，稀释，波长633 nm处Malvern激光粒度仪上测定其粒径和ξ电位。
       2.4.2    HCPT的含量测定精密称定1.0 mg HCPT置50 ml量瓶中，用pH 12.0 NaOH溶液(0.01 mol/L)配制浓度为20 μg·ml-1的溶液作为贮备液。紫外扫描结果表明其最大吸收波长为414 nm，且所有辅料在该波长处的紫外吸收对测定结果无干扰。另取贮备液分别配制浓度为0.2，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg·ml-1的溶液，以其在414 nm处的吸收光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，得标准曲线方程：A＝0.067 8C+0.001 3(r＝0.999 9)，表明HCPT在0.2～10.0 μg·ml-1浓度范围内线性关系良好。
       
       样品处理方法：取1.0 ml HCPT-SSLN用pH 5.0 PBS液稀释定容至25.0 ml，取其中1.0 ml于试管中，加入一定量的氯仿和pH 12.0 NaOH溶液，涡旋混匀离心，取上清液于414 nm处测定吸收光度。另取pH 5.0 PBS液1.0 ml，同法操作得空白对照品。
       
       回收率测定：取HCPT贮备液配制浓度为0.4，4.0，8.0 μg·ml-1的溶液，各取1.0 ml，用pH 12.0 NaOH溶液稀释到5.0 ml。另取1.0 ml空白纳米粒混悬液，用pH 5.0 PBS液稀释定容至25.0 ml。取1.0 ml分别加入上述3种浓度的溶液中，按“2.4.2”项下方法处理后测定，各浓度组重复3次。
       2.4.3  包封率(EE)测定包封率(EE)指被包封于纳米粒中的药物含量与投药总量的比值。精密吸取1.0 ml HCPT-SSLN混悬液上样于Sephadex G-50柱，以pH5.0PBS液洗脱，洗脱速度为1 ml·min-1，收集乳白色流分，取1.0 ml按“2.4.2”项下方法处理，测定包封在脂质体内的HCPT浓度C1；另取1.0mlHCPT-SSLN混悬液，加pH5.0PBS液稀释到25.0 ml，同法测定脂质体制剂中的HCPT浓度C2，EE=C1/C2×100%。
       2.4.4  载药量(DL)测定载药量(Drug Loading Coefficient，DL)系指纳米粒中所含药物量占制剂总量的百分率。即DL=投药量×EE /HCPT-SSLN冻干粉总量×100％。
       2.4.5  稳定性考察取适量HCPT-SSLN纳米溶液分别置于室温(25℃)、4℃条件下放置6个月，考察其稳定性。观察项目为外观、形态、粒径及包封率。
       2.5  统计学处理数据采用SPSS12.0软件处理，±s表示，P<0.05时有显著性差异。
       3  结果
       3.1  单因素考察在文献调查及单因素考察的基础上可知：HCPT是主药；十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油是基本脂质膜材；大豆卵磷脂一有乳化作用，能增加脂质膜的稳定性，防止药物渗漏；二有抗氧化作用，防止HCPT和脂质氧化；还有脱模、降低粘度及分散作用等；Solutol HS 15主要作为稳定剂和分散剂；丙酮和乙醇有利于溶解各种脂质材料，并维持HCPT内酯形式；因而最后筛选出来的基本处方组成为：HCPT、十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油、大豆卵磷脂、Solutol HS 15、丙酮和乙醇。
       
       另由考察确定以下参数：表面活性剂为Solutol HS 15：Soya lecithin为1∶1，有机相溶剂采用12 ml丙酮：6 ml乙醇，水相与油相比为1.5/1，有机相注入水相选定2.0 ml/min的滴速，搅拌速度为800 r/min，乳化蒸发搅拌时间为2h。此外，固态脂质与液态脂质的摩尔比对包封率影响明显，2/1时包封率最高，将其范围定为1/2～4/1；药脂比对包封率和粒径影响明显，1/8时制备工艺不稳定，将其范围定为1/40～1/15；表面活性剂过少则不能制备，过量易引起粒子聚合，故将其浓度范围定为1.5%～5％；这3个因素仍需进一步考察优化。
       3.2  正交设计实验因素和水平见表1，正交设计表及结果见表2，方差分析结果见表3。
       表1  因素水平（略）
       表2  正交设计HCPT-SSLN的结果（略）
       表3  F检验的结果（略）
       
       由表2可见，各个因素不同水平对SSLN包封率的影响由大到小依次为：A1＞A3＞A2，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1；R为极差值，RC＞RB＞RA，即表面活性剂浓度对SSLN的包封率影响最大，其次是固态脂质与液态脂质的摩尔比，再次是药脂比；当表面活性剂浓度为5％时，包封率均在70％以上；而当表面活性剂浓度只有3％时，包封率几乎都不超过55％；为了保证药效，包封率是关键性指标，故我们选取A1B2C3为最佳处方条件，即药脂比为1∶20，固态脂质与液态脂质的摩尔比为2∶1，表面活性剂浓度为5％，例如，以投药量10mg计算，需十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油各66.7mg，大豆卵磷脂和Solutol HS 15各450 mg。
       
       由表3可见只有C因素的F值大于Ｆ0.05(2,2)，说明只有表面活性剂浓度对包封率的影响有统计学意义，为主要影响因素，其次为固态脂质与液态脂质的摩尔比，再次是药脂比。
       
       经验证，3批样品平均包封率为81.43％。
       3.3  HCPT-SSLN纳米溶液的质量评价
       3.3.1    形态、粒径分布测定所制备的HCPT-SSLN混悬液为均一、稳定的半透明状分散系，体系略带淡蓝色乳光。激光散射法测定3批样品的平均粒径为（130.5±14.41）nm，多分散系数为0.18，说明粒径分布均匀；透射电镜观察结果表明，纳米粒为圆整的球状体，无明显团聚现象。对电镜所拍摄的粒径数据(N=502)采用SAS软件进行正态统计分析，结果粒径呈非正态分布，结果见图1。
       图1  HCPT-SSLN的TEM图（原放大倍数：×5 000）（略）
       3.3.2     ξ电位测定ξ电位与纳米粒体系的稳定性密切相关。测定ξ电位可以预测纳米粒的储藏稳定性。3批纳米粒ξ电位平均为（-33.1±3.30 ）mV，见表4。
       表4  HCPT-SSLN的粒径、ξ电位、包封率和载药量的测定结果（略）
       3.3.3  包封率、载药量和回收率预实验表明PBS液(pH＝5.0)能完全洗脱脂质体，但对游离HCPT无洗脱能力，故该测定方法可靠。测得包封率为（79.19±2.78）％，RSD为3.51％，载药量为（2.51±0.17）％，RSD为6.69％（见表4）。平均回收率为（100.31±1.14）％，RSD为1.14％。
       3.3.4  pH   3批样品用pH计测定，pH值分别为6.26，6.29，6.31，平均（6.29±0.023），RSD为0.366％。
       3.3.5  冻干粉的水分散性及粒径分析冻干粉样品呈现白色疏松块状，注射用水及生理盐水中分散性良好。另取少许粉末，同“2.4.1”项下操作，Malvern测得平均粒径为（138.9±15.28）nm。
       3.3.6   稳定性考察HCPT-SSLN纳米溶液于室温(25℃)避光放置6个月后，出现了霉菌、絮状或胶状沉淀，黄色药物结晶析出等现象。4℃条件下避光放置6个月后，无沉淀及药物结晶析出，为均一、稳定的半透明状分散系，且测得平均粒径为（141.8±7.84）nm，包封率为（77.29±1.63）％，表明在4℃条件下该制剂的稳定性要比常温下好。
       4  讨论
       
       HCPT的溶解性较差，在正辛醇中的表观溶解度是其在蒸馏水中的27.2倍，HCPT还能插入磷脂酰基链中，有一定亲和力［7］。其常见临床用量为5～15mg/d，故以大量脂质来包封少量HCPT是可行的。固体脂质纳米粒的制备方法很多，因为HCPT不溶于水，与磷脂有一定的亲和力，当HCPT溶于有机溶媒后与水溶液接触时，HCPT即大量析出。鉴于此性质，采用乳化蒸发法较好，推测制备原理是使HCPT在高速搅拌过程中进入熔化的脂质液滴，插入磷脂双分子层中而被脂质核包封，内外水相中的游离药物有部分吸附在脂质核表面，这样制备的纳米粒有较高的包封率，但具体脂质与HCPT的作用关系还需进一步研究。
       
       HCPT在液体脂质中的溶解度比在固体脂质中大，引入液体脂质可增大其包封率，因此在固体脂质载体中引入Corn oil制备SSLN，液态脂质的加入还能延缓固态脂质由α晶型向β晶型的转化和减少药物的渗漏［8］。
       
       本实验选择已正式收入欧洲药典的Solutol HS 15作为水相中的表面活性剂，因为和其他非离子表面活性剂相比，它除了具有更好的增溶稳定性，更低的机体代谢毒性，还在体外抗表皮样癌实验中表现出明显的抗多药耐药性，被认为是一种潜在的抗肿瘤治疗因素［9］，目前被广泛应用于静注、口服等多种剂型的辅料。单因素考察结果也说明它能有效增进HCPT的溶解性，增加SSLN包封率和稳定性。
       
       通过考察诸多对HCPT-SSLN粒径和包封率有影响的单因素，本实验筛选出药脂比、固态脂质与液态脂质的摩尔比、表面活性剂浓度为制备的3个关键要素，并通过正交设计获得了优化工艺和处方，但方差分析结果说明只有表面活性剂浓度对包封率的影响有统计学意义，故还存在对包封率、粒径影响较大的其它因素，有待进一步研究。
       
       通过质量评价，本实验所制备的HCPT-SSLN包封率和载药量较高，粒径分布均匀，稳定性良好，为羟基喜树碱的临床应用提供了更广阔的前景。
       【参考文献】
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