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       【摘要】 
       目的以槲皮苷、槲皮素含量为指标，考察不同炮制方法对侧柏叶止血成分含量的影响。方法采用RP-HPLC法测定不同炮制品中槲皮苷、槲皮素的含量，色谱柱为Lichrospher C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-0.2％磷酸溶液(38∶10∶52)；流速1.0 ml·min-1；检测波长254 nm；柱温25℃。结果不同炮制品中槲皮苷、槲皮素的含量有显著差异，槲皮苷的含量以生品最高，炭品最低；槲皮素的含量变化为：炒炭品﹥炒焦品，其它炮制品未检出槲皮素。结论随着炮制温度的升高，槲皮苷的含量逐渐减少；炒炭后止血作用增强，推测与炭品中槲皮苷部分分解生成槲皮素有关。
       【关键词】  侧柏叶； 炮制品； 槲皮苷； 槲皮素； 反相高效液相色谱法
       Determination of Quercitroside and Quercetin in Different Preparations of Cacumen Platycladi by RP-HPLC
       WU Huaien, ZHEN Hanshen, WEI Zhiying, CHEN Chenglin
       （ Guangxi University of TCM ,Nanning，Guangxi 530001,China）
       AbstractObjectiveTo determin quercitroside and quercetin in different preparations of Cacumen Platycladi by RPHPLC，and to observe the content variety of hemostatic components. MethodsThe separation was performed on Lichrospher C18（250 mm × 4.6 mm, 5  μm）, the mobile phase was consisted of MeOH - Acetonitrile - 0.2% Phosphoric acid  (38∶10∶52), with 1.0 ml·min-1of flow rate at 25℃, the wavelength for measurement was at 254nm. ResultsThere was marked quantitative difference of quercitroside and quercetin among different preparations of Cacumen Platycladi. The content of quercitroside was the highest in the crude and that of quercetin was the highest in the carbon. ConclusionThe content of quercitroside in different preparations varies with temperature. Quercitroside in the carbon is decompounded partially to be quercetin which enhances possibly the hemostatic effect.
       Key words：Cacumen Platycladi;   Preparations;   Quercitroside;   Quercetin；  RP-HPLC
       
       侧柏叶为柏科植物Platycladus orientalis (L.) Franco的干燥枝梢及叶。其性寒、味苦涩，入肺、肝、脾经，具有凉血止血、生发乌发之功效，可用于治疗吐血衄血、咯血、便血、崩漏下血、血热脱发、须发早白等症［1］。侧柏叶作为治疗出血症之要药，其炮制方法历代本草记载有“生用”或“炒用”［2］ ；“烧灰存性”［3］；“炒黑”［4］ 或“炙微黄”［5］等，现代生制并用。侧柏叶生品多用于血热妄行的吐血衄血，咳喘及脱发；侧柏叶炭则偏于收涩止血，多用于各种出血症。2005年版《中国药典》仅对生品中槲皮苷进行含量测定。近代炮制研究报道，侧柏叶制炭后槲皮苷部分分解生成槲皮素［6］ 。本实验以槲皮苷和槲皮素为指标，对侧柏叶不同炮制品中的含量进行测定，为合理制定其炮制工艺及控制炮制品的质量提供依据。
       1  仪器与试药
       
       Agilent 1100Series型高效液相色谱仪：G1311A四元泵、G1314A紫外检测器、G1316A柱温箱（美国安捷伦科技公司）；Lichrospher C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）(江苏汉邦科技有限公司)；KQ-200VDB型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER AE100电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；LG16-W型离心机（北京医用离心机厂）。甲醇、乙腈均为色谱纯，水为高纯水，其他试剂为分析纯。
       
       侧柏叶购自南宁医药有限责任公司，经广西中医学院中药鉴定教研室蔡毅副教授鉴定为柏科植物Platycladus orientalis(L.) Franco的干燥枝梢及叶。
       
       槲皮苷对照品（供含量测定用，批号：111538-200504）、槲皮素对照品（供含量测定用，批号：100081-200406）均购自中国药品生物制品检定所。
       2  方法与结果
       2.1  不同侧柏叶炮制品的制备［7］
       2.1.1  生品  取侧柏叶，除去杂质及枝梗，粉碎。
       2.1.2  炒黄品  取净侧柏叶，用文火炒至表面颜色加深，有香味发散时起锅放凉。
       2.1.3  炒焦品  取净侧柏叶，用文火炒至表面有焦斑，起锅放凉。
       2.1.4  炒炭品  取净侧柏叶，用中火炒至表面棕褐色，断面带棕心起锅放凉。
       2.1.5  醋炙品取净侧柏叶，按100∶20加醋，先闷润，再用文火炒干即得。
       2.1.6  盐炙品  取净侧柏叶，按100∶2加食盐，先闷润，再用文火炒干即得。
       2.1.7  水蒸品  取净侧柏叶，置锅中隔水蒸2h至软，表面暗绿色发亮，45℃烘干。
       2.1.8  酒蒸品  取净侧柏叶，按100：10的酒拌匀闷润，置锅中蒸2h至发软，45℃烘干。
       2.2  检测波长的选择  分别精密吸取槲皮苷对照品溶液、槲皮素对照品溶液各10 μl注入高效液相色谱仪，在二极管阵列检测器上于200～400 nm 波长处测定吸收光谱。槲皮苷对照品溶液在254 nm处有最大吸收峰，槲皮素对照品溶液在256 nm处有最大吸收峰，因此检测波长选定为254 nm。
       2.3  色谱条件  色谱柱为Lichrospher C18 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-0.2％磷酸溶液(38∶10∶52)；柱温：25℃；流速1.0 ml·min-1；进样量10 μl。以槲皮苷峰计算，理论塔板数不低于2 500，以槲皮素峰计算，理论塔板数不低于3 000，色谱图见图1～2。
       图1  槲皮苷、槲皮素对照品HPLC 图谱（略）
       图2  侧柏叶不同炮制品HPLC图谱（略）
       2.4  对照品溶液的制备  分别精密称取干燥至恒重的槲皮苷对照品11.2 mg，槲皮素对照品11.0 mg，分别置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密吸取槲皮苷对照品储备液2.7 ml，槲皮素对照品储备液0.9 ml于同一5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀作为混合对照品溶液。
       2.5  供试品溶液的制备  分别称取侧柏叶生品及各炮制品粉末（过2号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞称重，浸泡过夜，超声提取30 min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，离心作为供试品溶液。
       2.6  线性关系考察按“2.3”项下色谱条件，精密量取槲皮苷、槲皮素混合对照品溶液1，4，8，12，16，20，28 μl，注入高效液相色谱仪，分别测定槲皮苷与槲皮素的峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得槲皮苷与槲皮素的回归方程分别为： Y=2 942.881  2X-10.443 7（r=0.999 7），Y=4 150.170 1X-3.458 3（r=0.999 8）。
       
       结果表明，在上述色谱条件下，槲皮苷进样量在0.060 48～1.693 44 μg范围内，槲皮素进样量在0.019 8～0.316 8 μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。
       2.7  精密度实验  吸混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件，重复进样5次。测得槲皮苷峰面积的RSD为0.16％（n=5），槲皮素峰面积的RSD为0.34％（n=5）。
       2.8  稳定性实验 取同一炒炭品溶液，在24 h内每隔一定时间测1次，一共测5次，槲皮苷峰面积的RSD为2.03%（n=5），槲皮素峰面积的RSD为0.19%（n=5）。结果表明，在24 h内被测物稳定。
       2.9  重复性实验取炒炭品粉末1 g，精密称定，共5份，按“2.5”项下方法进行溶液制备，并按“2.3”项下色谱条件进行测定，结果测得槲皮苷的平均含量为0.150 5 mg/g，RSD为1.04％，槲皮素的平均含量为0.862 3 mg/g，RSD为0.63％。结果表明，本法重复性较好。
       2.10  加样回收实验取已测定含量的炒炭品（槲皮苷含量为 0.150 5 mg/g，槲皮素为0.862 3 mg/g）约0.5 g，精密称定，共称取5份，分别置50 ml量瓶中，各加入一定量的槲皮苷与槲皮素对照品，按“2.5”项下方法制成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定。测得槲皮苷平均回收率为100.27%（n=5），RSD为1.69%，槲皮素平均回收率为101.31%（n=5），RSD为1.08%。结果表明该测定方法符合定量分析的要求。见表1～2。
       表1  槲皮苷加样回收实验结果（略）
       表2  槲皮素加样回收实验结果（略）
       2.11  样品含量测定　分别取侧柏叶生品及不同炮制品约1 g各3份，精密称定，按“2.5”项下供试品溶液制备方法及“2.3”项下色谱条件，精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测定，并计算各样品中槲皮苷和槲皮素含量。结果见表3。
       表3  槲皮苷、槲皮素样品测定结果（略）
       “-”表示无检出量；n=3
       3  讨论
       
       槲皮苷与槲皮素均为侧柏叶止血的有效成分，因此选择槲皮苷、槲皮素作为质量控制的指标。《中国药典》仅收载侧柏叶生品中槲皮苷的含量测定，本实验同时测定两者含量的变化情况，可为侧柏叶的质量控制提供科学依据。
       
       侧柏叶为治出血症之要药，生用凉血止血，炒炭后止血作用增强。实验结果表明，不同炮制品中槲皮苷的含量变化依次为：生品>炒黄品>醋炙品>盐炙品>酒蒸品>炒焦品>水蒸品>炒炭品；槲皮素的含量变化依次为：炒炭品>炒焦品，在其它炮制品中均未检出槲皮素。说明在炮制过程中因温度影响，槲皮苷受到不同程度的破坏，部分分解生成槲皮素。
       
       在生品HPLC的色谱图中仅检出槲皮苷峰，而在炭品中则检出另外两个新的成分峰，一个峰经检测为槲皮素，另一与槲皮苷相邻的峰可能为炮制过程中产生的新的化合物，有待于进一步研究。
       
       实验过程中曾采用甲醇-0.2%磷酸（55:45）、乙腈-0.2%磷酸（48:52）作为流动相，但峰形不佳。实验结果发现采用甲醇-乙腈-0.2%磷酸（38:10:52）为流动相则分离效果较为理想，因此本法采用此流动相。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：149.
       
       ［2］ 明·李时珍.本草纲目［M］.北京：人民卫生出版社，1980：1913.
       
       ［3］ 徐楚江.中药炮制学［M］.上海：上海科技出版社，1985：61.
       
       ［4］ 清·黄宫绣.本草求真［M］.上海：上海科技出版社，1979：231.
       
       ［5］ 宋·王怀隐.太平圣惠方［M］.北京：人民卫生出版社，1958：1123.
       
       ［6］ 孙立立，杨书斌，江 波，等.炮制对侧柏叶化学成分的影响［J］.中成药，2006，28（6）：821.
       
       ［7］ 卫生部中医研究院中药研究所,卫生部药品生物制品检定所.中药炮炙经验集成［M］.北京：人民卫生出版社，1963：212.