文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨川芎挥发油解热作用机理。方法采用免疫组化及RT-PCR方法对啤酒酵母发热大鼠下丘脑组织环氧化酶－2（COX-2）蛋白及mRNA表达的影响进行研究。结果模型组大鼠下丘脑COX-2蛋白和mRNA表达均高于正常对照组（P<0.01），川芎挥发油高、中剂量组COX-2蛋白和mRNA表达低于模型组（P<0.01或P<0.05），低剂量组与模型组相比无明显差异（P>0.05）。结论川芎挥发油解热机理之一可能是抑制大鼠下丘脑COX-2的表达从而减少PGE2的产生使中枢体温调定点下调达解热效应。
       【关键词】  川芎挥发油； 解热； 环氧化酶-2
       Effect of Essential Oil of Ligusticum chuanxiong Hort on the Expressions of COX-2 in Hypothalamus of Fever Rat
       YANG Jinrong，SONG Jun，HU Rong，HUA Hua，LI Li
       (Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075，China；Sichuan Academy of Chinese Medical Sciences,Chengdu 610041，China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the antipyretic mechanism of essential oil of ligusticum chuanxiong Hort(CH).MethodsExpressions of COX-2 protein and mRNA in hypothalamus of brewer"s yeast-induced fever rats were checked using IHC and RT-PCR.ResultsExpressions of COX-2 protein and mRNA in hypothalamus of model group were higher than normal group, high and middle doses of CH could significantl decrease the expressions as compared with model group, but low dose of CH had no obvious effect. ConclusionOne of the antipyretic mechanism of essential oil of Ligusticum chuanxiong Hort.(CH) may be inhibit the expression of COX-2 protein and mRNA in hypothalamus of rats, thereby reduce the content of PGE2 that lowers the set point and produces antipyretic effect.
       Key words：Essential oil of Ligusticum chuanxiong Hort. ；  Antipyretic；  COX-2 
       
       笔者前期研究发现川芎挥发油(CH)具有明显的解热、镇痛、抗炎作用，且其解热机理与降低下丘脑PGE2含量有关（杨金蓉《川芎挥发油解热作用部分机理研究》.成都中医药大学2002博士学位论文）。环氧化酶（COX）是前列腺素生物合成的关键酶，有两种不同类型：COX-1和COX-2。其中，COX-1是一个组成酶，与生理性前列腺素合成有关；COX-2则是一个诱导酶，可以被脂多糖等多种因子诱导，与发热、炎症密切相关［1］。为进一步探讨川芎挥发油解热作用的机理，我们观察川芎挥发油对发热大鼠COX-2表达的影响。
       1  器材与方法
       1.1  药物  川芎挥发油：川芎购于都江堰市徐渡乡，经成都中医药大学鉴定教研室鉴定为Ligusticum chuanxiong Hort.。川芎经水蒸气蒸馏法提取挥发油，无水硫酸钠脱水后备用。临用时以1%吐温80配成所需浓度乳剂。
       1.2  试剂及仪器  啤酒酵母：将新鲜啤酒酵母(成都啤酒厂提供)于鼓风条件下60℃烘干，粉碎，过100目筛后低温保存，临床用时以水调制为20%的悬液备用，用时摇匀。安痛定：成都制药一厂生产，批号20010507。COX-2免疫组化试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司产品。TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒：宝生物工程（大连）有限公司产品。WZ-03温度仪:上海医用仪表厂制造。PCR仪：美国PE公司产品。凝胶成像系统、电泳仪：美国伯乐公司产品。高速冷冻离心机：sigma公司产品。BP211D电子天平：德国骞多利斯产品。OLYMPUS显微镜：日本产品。
       1.3  动物SD成年雄性大鼠，体重（200±20）g，共60只，购于成都中医药大学实验动物中心，合格证号，川室动管字第8号。
       1.4  方法参照文献［2］，动物在实验环境［实验室温度控制在（25±1）℃，相对湿度（60±2）%］中每日测肛温（测温探头插入肛门2 cm）两次，连续5 d，使其适应。实验前10 h禁食不禁水。实验前间隔30 min测肛温两次，取两次平均值作为大鼠的基础体温，（两次肛温波动＞0.3℃者淘汰）。选取基础肛温在(36.6±0.5)℃之间的SD雄性大鼠适量，取其中8只作为正常对照组（ip生理盐水），其余大鼠背部皮下注射20%啤酒酵母混悬液10 ml/kg，每30 min测肛温1次。6 h后, 升温不足0.8℃者淘汰。立即将筛选合格的大鼠按升温幅度和体重分层随机分为5组，每组8只，即模型组（ip生理盐水），阳性药组（安痛定），川芎挥发油高、中、低剂量组（分别ip 0.68%，0.23%，0.11%的川芎挥发油）。各组均等容积不等浓度ip给药，5 ml/kg。然后每隔30 min测肛温1次。给药2 h后，快速断头取下丘脑作相应处理供测试相关指标。
       1.4.1  COX-2蛋白表达的观察（免疫组化法）标本组织常规酒精脱水、透明、石蜡包埋切片，切片厚度4 μm，SABC法染色，DAB显色。高倍镜下随机选取4视野，计数每100个细胞中COX-2阳性细胞数。采用PEMS3.0进行统计分析。
       1.4.2  COX-2 mRNA表达的观察（RT－PCR法）COX-2和β-actin引物根据文献［3］，并在GenBank进行核对后，由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下：COX-2：上游引物5′－CCAGCACTTCACCCATCAGTT－3′，下游引物5′－AAGGCGCAGTTTATGTTGTCT－3′；βactin：上游引物5′－GAGGCCCAGAGCAAGAGAGG－3，下游引物上5′－TCACCGGAGTCCATCACGAT－3′。按试剂盒提供的方法提取下丘脑组织中的总RNA，经逆转录酶系统合成cDNA第一链，然后进行PCR反应。PCR条件：①变性：94℃，1 min；②退火：55℃，1 min；③延伸72℃，2 min。30个循环于PCR仪进行COX-2扩增。取5 μl PCR扩增产物加1 μl上样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，于紫外线下观察，利用凝胶成像系统分别测定扩增条带的积分光密度值。计算各组COX-2积分光密度值与其对应的β-actin的积分光密度的比值，并进行组间统计，判定川芎挥发油对COX-2mRNA表达的影响。
       2  结果
       2.1  对COX-2蛋白表达的影响  结果见表1。
       表1  川芎挥发油对大鼠脑组织COX-2表达的影响（略）
       与模型组比较，*P<0.05；**P<0.01；n=8
       
       实验结果表明发热模型大鼠下丘脑COX-2的表达显著提高，与正常组比较有极显著差异（P<0.01）；CH高、中剂量组及安痛定组COX-2的表达均显著降低，与模型组比较有极显著差异（P<0.01或P<0.05），提示CH可降低COX-2的表达，且有明显的量效关系。
       2.2  对COX-2mRNA表达的影响   结果见表2。
       表2  川芎挥发油对大鼠脑组织中COX-2mRNA表达的影响（略）
       与模型组比较，*P<0.05；**P<0.01；n=8
       
       实验结果表明正常大鼠仅有少量COX－2ｍRNA的表达，发热模型大鼠下丘脑COX-2ｍRNA的表达明显提高，与正常组比较有显著性差异（P<0.01）；CH高、中剂量组及安痛定组COX-2ｍRNA的表达均降低，与模型组比较有显著性差异（P<0.01或P<0.05）。实验结果提示CH可降低发热模型大鼠下丘脑COX-2ｍRNA的表达，且有明显的量-效关系。
       3  讨论
       
       下丘脑视前区(POA)是公认的体温调节中枢,Veale等将家兔两侧POA摘除后,向该部位或脑室注入PGE2,不能引起家兔发热［4］。PGE2在发热中起着非常重要的中介作用［5］。如前所述，COX-2，与发热、炎症密切相关［1］。土屋千佳子等［6］研究发现大黄对于LPS引起的大鼠发热反应有解热作用，并且大黄对COX活性以及COX－2 mRNA的表达均有抑制作用。我们前期研究发现川芎挥发油具有解热作用且能降低发热大鼠下丘脑PGE2含量（杨金蓉《川芎挥发油解热作用部分机理研究》.成都中医药大学博士学位论文）。本实验旨在进一步探索其对PGE2的影响是否是通过抑制下丘脑COX-2的表达实现的，川芎挥发油对下丘脑COX-2 mRNA及蛋白的表达均有明显的抑制作用，且有明显的量效关系。实验结果表明了川芎挥油解热作用的机制之一是通过抑制发热模型大鼠下丘脑组织中COX－2 mRNA表达从而抑制COX－2表达量，减少中枢发热介质PGE2的合成，从而使体温调定点下移而达到解热作用，这从更深层次揭示了川芎挥发油解热作用的机制。
       【参考文献】
         　　［1］ 李 玲，吴开春，樊代明.环氧化酶-2及其研究进展［J］.国外医学·分子生物学分册，1999，21（3）：174.
       
       ［2］ 沈映君，曾 南. 几种通草及小通草的抗炎,解热,利尿作用的实验研究［J］.中国中药杂志，1998；23（11）：687.
       
       ［3］ 林栋栋，孙家邦，李 非，等.环氧化酶-2在急性胰腺炎大鼠肺组织中的表达［J］.肠病学和肝病学杂志，2005，14(3):258.
       
       ［4］ 杨惠玲，潘景轩，吴伟康.高级病理生理学［M］.北京：北京科学出版社,1998：102.
       
       ［5］ Ushikubi F ,Segi E,Sugimoto Y,et al. Impaired febrile response in mice lacking the prostaglandin E2 receptor subtype EP3［J］.Nature ,1998;395:281.
       
       ［6］ 土屋千佳子．大黄及其成分对花生四烯酸代谢的影响［J］.日本药理学杂志，2003，121(1)：10.