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       【摘要】 
       目的通过观察麦冬细胞超声破壁时间和利用紫外分光光度法检测超声提取麦冬皂苷D含量两种考察指标来比较筛选麦冬皂苷D的提取条件，优化超声提取工艺。方法采用正交设计法，分别以麦冬细胞破壁时间和采用紫外分光光度法测定麦冬细胞破壁后皂苷D的含量为考察指标，考察乙醇浓度、温度、麦冬粒度和先期浸泡时间等因素对超声提取工艺的影响。通过显微镜观察，确定细胞破壁状况；通过对两种考察指标的实验结果进行比较，优化提取方案。结果利用紫外分光光度法测定麦冬皂苷D含量和通过观察麦冬细胞破壁所筛选的麦冬皂苷D最佳提取工艺的结果是一致的。在考察因素中，麦冬皂苷提取工艺影响程度为：粒度﹥乙醇浓度﹥先期浸泡时间﹥温度，超声提取最佳条件为：温度45 ℃，80 目粒度，95% 乙醇，先期浸泡12 h。结论通过超声方法对中草药有效成分进行提取，其提取率与细胞破壁有关，利用正交实验分析紫外分光光度法检测麦冬皂苷D含量和考察麦冬细胞破碎的结果是一致的，可通过观察麦冬细胞破壁结果来优化提取工艺，简化操作。
       【关键词】  超声； 细胞破壁； 麦冬皂苷D； 正交设计法； 工艺筛选
       麦冬Ophiopogon japonicus（Thunb.）Ker-Gaw1［1］为百合科沿阶草属植物，是常用滋阴中药，其味甘微苦，性微寒，归心、肺、胃经，具有养阴润肺、益胃生津、清心除烦的功效，传统中医主要将其用于肺、胃、心阴不足的病症。
       
       中草药中许多有效成分为细胞内成分，提取时需要破碎细胞壁，而现有的化学和机械方法破碎细胞很难起到理想的破碎效果［2］，影响提取率。超声提取包括机械粉碎、热学及空化作用［3，4］，由于3个方面的综合作用，加速了细胞的破碎，提高了有效成分的提出率。采用超声方法提取中草药中有效成分的文献已有很多 ［5～11］，但通过超声方法考察细胞壁破碎情况与提取效率的关系尚未见文献报道。本实验采用正交设计法，分别以麦冬细胞破壁时间和采用紫外分光光度法测定麦冬细胞破壁后皂苷D的含量为考察指标，考察了乙醇浓度、温度、麦冬粒度和先期浸泡时间等因素对超声提取工艺的影响，通过显微镜观察确定细胞壁破碎状况；通过对两种考察指标实验结果的比较，优化提取方案。
       1  仪器与材料
       
       UV－2550 SHIMADZU紫外分光光度计（日本岛津）；KQ5200E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Olympus X 40细胞生物显微镜（日本Olympus）；RT-5型中药粉碎机（浙江缙云县超力机械厂）；BS 224S型电子分析天平（北京塞多利斯天平有限公司）。
       
       麦冬，购自河北安国中药市场，产于四川，经鉴定本品为百合科沿阶草属植物麦冬的干草块茎；麦冬皂苷D标准品（含量98%，天津一方科技有限公司）；高氯酸（分析纯，天津东方化工厂）。
       2  方法与结果
       2.1  正交实验设计及各因素水平设定选取溶液温度（A）、麦冬粒度（B）、乙醇浓度（C）和浸泡时间（D）为主要考察因素，各因素的水平设定见表1。正交实验采用L9（34）正交表［12］，见表2。
       表1  超声破碎提取麦冬皂苷D实验水平（略）
       2.2  超声对麦冬细胞破壁的影响称取过80 目筛麦冬粉末5.0 g，加入 100 ml 95% 乙醇，先期浸泡12 h，在45 ℃条件下，超声30 min后，显微镜下观察其超声前后细胞壁变化情况（见图1～2）。结果表明，超声能使麦冬细胞壁破碎。
       2.3  标准曲线的绘制精密称取麦冬皂苷D 7.0 mg，置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容，精密吸取0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，5.0 ml标准溶液置于具塞试管中，挥干溶剂，加高氯酸10 ml，密塞，于60 ℃水浴加热15 min，冰水浴冷却，终止反应，以高氯酸作为空白对照，在295 nm和313 nm波长处测其吸收值。以浓度C对吸收差值△A作图，得到麦冬皂苷D的标准曲线方程为△A=0.299 C+0.008，相关系数为0.999 1。线性范围为0.7～35.0 mg·L-1。
       2.4  重复性实验称取过80目筛麦冬粉末5.0 g，放入具塞三角瓶中，用100 ml的95%乙醇溶液浸泡12 h。浸泡后在45 ℃恒温下，超声波振荡提取1 h，将提取液进行抽滤。然后将滤液移入旋转蒸发器中蒸发至干。向瓶中加入5 ml的高氯酸，密塞，60℃水浴加热15 min，冰水终止反应，以高氯酸作空白对照，进行紫外分光度检测。重复进行6次，所得结果RSD=0.97%，表明重复性良好。
       2.5  超声破壁提取麦冬皂苷D正交实验结果将麦冬药材粉碎，过筛，得到80，40，20目麦冬粉末。分别称取麦冬粉末适量，用100 ml溶剂浸泡一定时间，在一定温度下进行超声破碎，每隔5 min取样，显微镜观察，确定细胞破壁时间。将提取液抽滤，滤渣用少量蒸馏水冲冼，然后将滤液移入旋转蒸发器中蒸发至干；向瓶中加入5 ml的高氯酸，密塞，60℃水浴加热15 min，冰水终止反应，以高氯酸作空白对照，采用紫外分光光度法检测。
       
       分别采用极差法和方差分析法对正交实验的两个结果分别进行分析，确定各因素对实验结果的影响程度（见表2～3）。
       
       方差分析结果表明，通过紫外分光光度法检测麦冬皂苷D含量和利用观察麦冬细胞破壁时间来筛选麦冬皂苷D最佳提取工艺结果是一致的。影响提取率的主次因素为B﹥C﹥D﹥A，即粒度﹥乙醇浓度﹥先期浸泡时间﹥温度；最佳超声提取工艺为A2B1C2D2，即45 ℃ 条件下，80目粒度，95% 乙醇，先期浸泡12 h。
       表2  超声破壁提取麦冬皂苷D正交实验设计直观分析结果（略）
       图1  超声前麦冬细胞图（40×10）（略）
       图2  超声后麦冬细胞图（40×10）（略）
       表3  超声破壁提取麦冬皂苷D正交实验方差分析结果（略）
       本结果运用正交实验助手软件Ⅱ计算，＊表示有显著性（P﹤0.05）
       3  讨论
       3.1  粉碎粒度对细胞超声破壁的影响实验结果表明，粉碎粒度为20～60目时，超声2 h后细胞轮廓无显著变化；在80目时，经超声0.5 h麦冬细胞壁破碎，粉碎粒度与细胞超声破壁成正比，与正交实验分析结果是一致的。
       3.2  超声温度和先期浸泡时间对细胞破壁的影响在麦冬皂苷D超声提取过程中，温度因素和先期浸泡时间影响不显著。在实际提取操作中，一般采取较低的温度，以减少有效成分的降解，同时可以省去先期浸泡程序，简化操作步骤。
       
       通过超声方法对中草药有效成分进行提取，其提取率与细胞破壁有关，利用正交实验分析紫外分光光度法检测麦冬皂苷D含量和观察麦冬细胞破碎状况的结果是一致的，因此，可利用考察麦冬细胞破壁结果来优化提取工艺，简化操作，降低成本，缩减工作量。
       【参考文献】
         　　目的通过观察麦冬细胞超声破壁时间和利用紫外分光光度法检测超声提取麦冬皂苷D含量两种考察指标来比较筛选麦冬皂苷D的提取条件，优化超声提取工艺。方法采用正交设计法，分别以麦冬细胞破壁时间和采用紫外分光光度法测定麦冬细胞破壁后皂苷D的含量为考察指标，考察乙醇浓度、温度、麦冬粒度和先期浸泡时间等因素对超声提取工艺的影响。通过显微镜观察，确定细胞破壁状况；通过对两种考察指标的实验结果进行比较，优化提取方案。结果利用紫外分光光度法测定麦冬皂苷D含量和通过观察麦冬细胞破壁所筛选的麦冬皂苷D最佳提取工艺的结果是一致的。在考察因素中，麦冬皂苷提取工艺影响程度为：粒度﹥乙醇浓度﹥先期浸泡时间﹥温度，超声提取最佳条件为：温度45 ℃，80 目粒度，95% 乙醇，先期浸泡12 h。结论通过超声方法对中草药有效成分进行提取，其提取率与细胞破壁有关，利用正交实验分析紫外分光光度法检测麦冬皂苷D含量和考察麦冬细胞破碎的结果是一致的，可通过观察麦冬细胞破壁结果来优化提取工艺，简化操作。