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       【摘要】 
       目的研究缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在缺血再灌注脑组织中的表达。方法应用Realtime PCR方法，对HIF-1α在盐酸川芎嗪预处理的大鼠缺血再灌注脑组织中的表达进行检测。结果缺血再灌注组、假手术组和用药组中HIF-1α的mRNA的表达无明显统计学差异。结论缺血缺氧并非在基因转录水平对脑组织HIF-1α的表达进行诱导。
       【关键词】  缺氧诱导因子-1α 缺血再灌注 脑组织 基因表达
       缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是一种随着细胞内氧浓度变化而调节基因表达的快速转录因子，因其可诱导血管内皮细胞因子、促红细胞生成素及诱导性一氧化氮合成酶等靶基因的转录，而成为低氧应答反应的调控中心。作为治疗缺血性疾病的一种候选基因，HIF-1α在缺血性疾病中具有极大的应用价值［1］，近年来已成为缺血性脑血管病的一个研究热点。但脑组织发生缺血再灌注后HIF-1α在基因水平的表达规律和特点，以及中药对其表达的调控作用，国内外鲜见报道。本研究利用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，观察局灶性缺血再灌注对HIF-1α表达的影响及中药对其表达的调控，探讨其在脑缺血再灌注发生后的表达。
       1  材料与仪器
       1.1  动物SD大鼠，雌雄不限，体重（300±20） g，由南京中医药大学实验动物中心提供。
       1.2  试剂与仪器RevertAid TMFirst strand cDNA Synthesei Kit（Fermentans）；DR001AM Kit（TakaRa）；PTC-225 Peltier Thermal cycler PCR仪（MJ Research）；Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler荧光定量PCR仪（Corbett Reseach，Australia.）；Rotor-Gene 6.0分析软件。
       2  方法
       2.1  动物分组及造模大鼠随机分为缺血再灌注组、假手术组和用药组，每组10只。用药组于术前3 d开始，每天按8 mg/100 g体重腹腔注射盐酸川芎嗪，其余两组腹腔注射相应体积生理盐水。实验第4天采用Longa［2］颈外动脉线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。假手术组仅分离血管和神经，不插入线栓。用药组于缺血10 min后按8 mg/100 g体重腹腔注射盐酸川芎嗪，缺血再灌注组和假手术组于同样时间腹腔注射相应体积的生理盐水。
       2.2  标本制取于预定时间，以10%水和氯醛再次麻醉动物，37℃生理盐水250 ml经左心室灌注冲洗，直至右心耳流出清亮液体。大鼠断头后快速于冰盘上取出全脑，用锡箔包裹后置于液氮中保存。
       2.3  Real-Time PCR方法检测
       2.3.1  总RNA提取称取组织0.1 g放入装有1 ml Trizol的10 ml离心管中，在冰浴条件下匀浆至组织完全呈粉末状。加入200 ml氯仿，用力颠倒混匀，室温静置10 min，于4℃，13 000 r/min离心30 min，从每管中吸取上清液至另一1.5 ml离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃沉淀1 h。再次于4℃，13 000 r/min离心20 min，弃去上清液。加入500 μl 75％乙醇，洗涤沉淀。于4℃，13 000 r/min离心10 min，弃上清液。加入10 μl DEPC-Water至完全溶解，进行电泳并进行紫外分析测定。
       2.3.2  RNA样品反转录利用RNA反转录试剂盒进行RNA反转录，反转录体系：TaKaRa Taq（5 U·μl-1），0.13 μl；10×Buffer，2.5 μl；MgCl2，1.5 μl；Dnip Mixture，2 μl；Primer 1（20 μm），0.5 μl；Primer 2（20 μm），0.5 μl；DdH2O，加至25 μl。反应按照以下过程进行：① 95℃，2 min；② 95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，20 s；③步骤②为40个循环。
       2.3.3  荧光定量PCR 引物序列（HIF-1α：5"GCTCCGCCAACTCTCCCTTCC3"，5"GCTCCTGCCTCTAGTCTCC ACC3"），由上海欧易生物有限公司合成。
       
       PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测。选择反应产物专一，没有二聚体等杂带的样品进行下一步定量PCR反应。
       
       标准曲线制备：将预试验的PCR产物以10倍浓度梯度进行稀释，选择1/10 000，1/100 000，1/1 000 000，1/10 000 000浓度的稀释产物作为标准品模版，进行荧光定量PCR反应，并同时在荧光定量PCR仪中输入以上4个浓度梯度的浓度数值。通过这四个标准品生成的反应数据，软件Rotor-Gene 6.0根据反应的荧光实时监控数据和标准品的浓度关系，生成标准曲线。利用此标准曲线来计算在标准曲线所划定的Ct值。
       
       荧光定量PCR 反应：利用SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time） kit进行荧光定量PCR反应。反应体系：SYBR Premix Ex Taq，10.0 μl；Primer 1，0.4 μl；Primer 2，0.4 μl；DdH2O，8.2 μl。PCR反应条件：①95℃，2 min；②95℃，15 s；58℃，20 s；72℃，20 s；③步骤②为40个循环。实验结果利用软件Rotor-Gene 5.0以及 Excel 7.0进行数据分析处理。
       2.4  统计学处理应用SPSS10.0统计分析软件包进行数据处理，采用方差分析，P＜0.05为有差异即有统计学意义。
       3  结果
       3.1  绘制标准曲线 以不同定量模板起始拷贝浓度的对数为横坐标， 以Ct值即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数为纵坐标，得到标准曲线（见图1），r=0.999 92，符合要求。
       图1  标准曲线（略）
       3.2  实时荧光定量PCR测定结果不同脑组织中HIF-1α，18SrRNA的Ct值分别见图2～3，从图中可以观察到各样品中HIF-1α的PCR反应的变化趋势，根据不同脑组织中HIF-1α，18SrRNA的Ct值，从标准曲线上计算出各样品的起始拷贝数，进而计算出目标基因和内参基因起始拷贝数的比值用于进行统计分析。统计结果表明，各组HIF-1α mRNA的表达无明显统计学差异。
       图2  不同脑组织的HIF-1α Ct值（略）
       图3  不同脑组织中18 S rRNA Ct值（略）
       4  讨论
          
       HIF- 1是在缺氧诱导的细胞核提取物中发现的一种DNA结合蛋白，是被公认的缺氧调节中的重要因子［3］，能与靶基因结合，使机体对缺氧、缺血产生适应性反应。HIF-1由α、β两个亚基组成，其中α亚基是其主要活性单位，HIF-1的生物效应是由HIF-1α亚基实现的［4］。 正常情况下，HIF-1α不表达或表达很少，而在缺氧状态下，HIF-1α的表达可呈时间和缺氧程度的依赖性升高，HIF-1α蛋白的表达量和转录活性主要受细胞内氧浓度的调节。HIF-1α通过调节其靶基因如内皮素1、促红细胞生成素、血管内皮生长因子、诱导型一氧化氮合酶等基因来发挥作用［5］。目前认为缺氧条件下HIF-1α表达量增加的调节并不在HIF-1α mRNA水平，而是在HIF-1α蛋白翻译后水平，即通过增加HIF-1α蛋白的稳定性，抑制其降解来实现的［6］。
       
       本研究结果表明，缺血再灌注组、假手术组和用药组HIF-1α的mRNA表达无明显变化，提示缺血缺氧并非在基因转录水平对脑组织HIF-1α的表达进行诱导。
       
       目前已有不少学者就HIF-1α在脑缺血再灌注时的表达进行了研究，但在基因水平的研究尚为数不多。本实验运用Realtime PCR方法检测了HIF-1α在盐酸川芎嗪预处理的大鼠缺血再灌注脑组织中的mRNA转录水平，为研究HIF-1α在脑缺血再灌注时的表达提供了重要实验思路和手段。
       【参考文献】
         　［1］ 谭新杰,胡长林. 缺氧诱导因子-1α基因在成年大鼠局灶性脑缺血中的治疗作用研究［J］.中华医学杂志,2006,86(15)：1060.
       
       ［2］ Longa E Z, Weinstein P R, CarSon S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without cranitetory in rats［J］. Stroke, 1989, 20(1): 84.
       
       ［3］ 张 薇,李若溪,许建华,等. 低氧条件下大鼠视网膜HIF-1α及P53的表达及相关分析［J］.国际眼科杂志,2006,6(4): 795.
       
       ［4］ 赵荣瑞. 缺氧诱导因子-1（HIF-1）的基础研究与临床意义［J］.山西医科大学学报,2006,37(3):226.
       
       ［5］ 贾闪闪,骆健峰,胡良冈,等. 葛根素对慢性低氧高二氧化碳性肺动脉高压大鼠肺血管低氧诱导因子1α的影响［J］.中国新药与临床杂志,2006,25(6): 444.
       
       ［6］ Fedele A O, Whitelaw M L, Peet D J. Regulation of gene expression by the hypoxia-inducible factors ［J］. Mol Interv, 2002, 2:229.