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       【关键词】  泼尼松；,,糖皮质激素；,,神经系统；,,健脑胶囊；,,大鼠
       摘要：目的探讨长期大量应用泼尼松对大鼠中枢神经系统的毒性作用，同时观察中药复方健脑胶囊对泼尼松性神经系统损害的防治作用。方法4月龄SD雄性大鼠50只随机分成5组，除正常组外其余4组予泼尼松2.7 mg・kg1灌胃，1次/d，连续12周。健脑胶囊治疗组同时予健脑胶囊3种剂量提取液 (2.5， 5.0， 10.0 g・kg-1・d-1)予治疗。实验中测试大鼠的应激记忆力，测定脑匀浆中MAO，SOD，AchE、MDA的含量以及对大脑进行组织学检查。结果单用泼尼松大鼠的三臂电迷宫正确率、脑匀浆中的SOD含量显著下降而MAO含量上升（P<0.01）；脑神经元发生水肿变性，皮质厚度变薄，皮层和海马结构紊乱，而健脑胶囊可有效保护神经元及升高SOD的含量及降低MAO的含量以及提高迷宫正确率（P<0.05）。结论 泼尼松长期应用可造成大鼠中枢神经系统功能减退，健脑胶囊对其有较好的对抗作用，但量效关系不明显。
       关键词：泼尼松；  糖皮质激素；  神经系统；  健脑胶囊；  大鼠
       The Preventive Effects of Jiannao Capsule on Cerebra Damage Induced by Prednisone in Rats
       ZOU Liyi，  WU Tie， CUI  Liao， XU Bilian， ZHANG Xinle
       (Dept of Pharmacology , Guangdong Medical College, Zhanjiang  524023， China)
       Abstract：ObjectiveTo study the cerebral damage induced by long-term administration of prednisone, and investigate the prevention effects of  Jiannao capsule on rats.  MethodsFifty fourmonth SD male rats were randomly divided into 5 groups with 10 rats per group. Group 1 was treated orally with vehicle as control (NS group), other groups were administered oraly with prednisone (2.7 mg・kg-1・d-1) first, and then with vehicle (PD group), or water extract of Jiannao capsule with three different doses (2.5, 5.0, 10.0g・kg-1・d-1), once a day for 12 weeks. Then the 10%  cerebrums inhomogenate was used to test the content of monoamine oxidase (MAO), superoxide dismutase (SOD) and acetylcholinesterase (AchE). The right half of cerebrums was used for testing the histological observation.ResultsBiochemical parameters of cerebrums plasm showed that the concentration of MAO increased,  SOD and AchE decreased significantly in PD group. Moreover, histopathology showed that the structure of cerebrum cortex became thinner and hippocampi was in disorder. Dropsical and necrotic nerve cells were found. The water extract of Jiannao could prevent the changes of nerve centre in prednisone rats. ConclusionThe treatment of Jiannao Capsule can prevent the damage of nerve centre which caused by prednisone.
       Key words：Prednisone;   Glucocorticoid ;  Cerebra damage;  Jiannao capsule;  Rats
   
　　糖皮质激素是有肾上腺皮质分泌的一种具有神经活性的甾体激素，其产生直接受到下丘脑垂体肾上腺轴的影响，可对神经系统的发育和功能有深刻的影响［1］。研究表明，超生理剂量的糖皮质激长期应用不但损害外周的免疫系统和心血管系统等，还会对中枢神经系统尤其是对海马神经元产生毒性作用［2］，临床上也观察到某些患者在接受大剂量的糖皮质激素长期治疗后出现记忆力下降、精神失常、甚至痴呆的现象。由于糖皮质激素对神经系统的作用尚未明了，因此在本实验中研究了泼尼松长期超生理量应用对动物智力和脑组织结构的影响，以探讨糖皮质激素对中枢神经系统损伤的可能作用原理以及研究中药健脑胶囊对其的防治作用。
       　1  材料与方法
       1.1  动物   4月龄未交配的SpragueDawley（SD）雄性大鼠50只，SPF级，平均体重(228±10)g，由广东医学院实验动物中心提供（广东省实验动物质量合格证编号：2002A014）。饲养在(25±1)℃的恒温及湿度为40%~70%的空调环境中,隔日换垫料，专室饲养，专人负责；使用经严格消毒后的标准饲料和纯净过滤水进行喂养，所有动物分笼饲养，确保实验动物有足够的活动空间，可自由摄食、摄水。
       1.2  药物与试剂  醋酸泼尼松：原料，浙江仙居制药股份有限公司生产（批号981220）；健脑胶囊水提液高、中、低剂量：由广东医学院医药科技开发中心提供（030807）。单胺氧化酶测试盒（MAO）测定试剂盒、（MDA）丙二醛测定试剂盒、乙酰胆碱酯酶（TCHE）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均由南京建成生物工程公司提供。
       1.3  仪器 LEICA QWIN图象分析仪（德国莱卡）；752紫外分光光度计(上海第三医学仪器厂生产)；电感偶合等离子体直读光谱仪（日本岛津）；梅特勒－托利多AE240电子天平（梅特勒－托利多仪器公司上海分公司）；MG2型迷宫刺激器（张家港市生物医学仪器厂）。动物分组及处理：50只SD大鼠的体重按照Microsoft Excel 带的宏程序Analys32.x11产生随机数列，并利用产生的随机数列进行分组，一共分为5组，每组10只，具体为（1）NS组：正常对照组，每天先予NS按5 ml・kg1灌胃1次，1 h后重复。（2）PD组：泼尼松模型组，每天予泼尼松2.7 mg・kg1灌胃，后灌予NS 5 ml・kg1。（3）健脑胶囊高剂量组（JLH）：予泼尼松2.7 mg・kg1・d 1灌胃，后予健脑胶囊高剂量提取液（含淫羊藿，丹参，甘草等，每100 ml含生药量100 g）按5 ml・kg1灌胃给药；（4）健脑胶囊中剂量组（JLM）：泼尼松2.7 mg・kg1・d 1灌胃，后予健脑胶囊中剂量提取液（含淫羊藿，丹参，甘草等，每100 ml含生药量50 g）按5 ml・kg1灌胃给药。（5）健脑胶囊低剂量组（JLL）：泼尼松2.7 mg・kg1・d 1灌胃，后予健脑胶囊低剂量提取液（含淫羊藿、丹参、甘草等，每100 ml含生药量25 g）按5 ml・kg1灌胃给药。所有动物按照随机原则分组后观察1 d，第2天开始灌胃给药，qd，连续12周。
       1.4  观察指标
       1.4.1   三臂迷宫正确率大鼠在实验结束前1周用MG2型三臂迷宫刺激器检测其对刺激的记忆反应能力，实验前先测试大鼠在受到电刺激后首先逃避的方向，如逃向左侧常见，则以左侧定为电击区（如Ⅱ区），右侧为安全区（如Ⅲ区）；实验正式开始时，Ⅰ臂为起步区，其中Ⅰ和Ⅱ带电，而Ⅲ不带电，第1天先训练动物建立记忆痕迹，每只大鼠先跑20次，记录其正确率，24 h后重复，但此次电击前先延时5 s，同时给红灯提示，观察大鼠受激反应情况，72 h后再重复，记录实验中大鼠的正确次数和错误次数，计算其正确率。
       1.4.2  脑指标测定 在低温条件下条件下迅速取左侧大脑于20℃急冻，用于制成10%匀浆测定MAO、SOD、AchE、MDA的含量，并取右侧大脑用Bouin液固定，常规石蜡包埋后切片，HE染色，脑切片用于观察海马和皮层的结构变化。
       1.5  统计学处理所有测定指标均采用均数加减标准差的形式表示（±s ），数据分析使用SPSS软件中的方差分析（ANOVA）进行检验，先用Levene"s test对数据进行方差齐性检验，如方差齐用Bonferroni检验，如方差不齐则用Tamhane"s T2 检验，以P<0.05，P<0.01表示具有统计学意义。
       　2  结果
       2.1  健脑胶囊对泼尼松大鼠三臂迷宫检测正确率的影响 各组大鼠三臂迷宫正确次数（CT）、错误次数（ET）和正确率（%CR）见表1。
       表1  健脑胶囊对泼尼松大鼠迷宫正确率的影响（略）
       与NS组比较，PD组大鼠活动明显减少，活动减少，对外界刺激的反应能力显著下降，由表1可以看出，迷宫测试实验中%CR显著下降（P<0.01），提示长期使用泼尼松可使大鼠发生记忆力衰退。健脑胶囊治疗3组中，%CR虽然比NS组下降，但与PD组比, JLH组大鼠迷宫正确率却显著提高（P<0.01），JLM组和JLL组也明显提高（P<0.05），且JLH组的%CR与NS组相比差异无显著意义。提示健脑胶囊有效改善泼尼松所致的大鼠记忆能力衰退作用。
       2.2  健脑胶囊对泼尼松大鼠脑匀浆生化指标的影响各组大鼠大脑重量（CW）及脑匀浆中MAO（单胺氧化酶）、SOD（超氧化物歧化酶）、AchE（乙酰胆碱酯酶）、MDA（丙二醛）含量影响见表2。
       表2  健脑胶囊对泼尼松大鼠脑匀浆生化指标的影响（略）
       与NS组比较， 使用泼尼松后几组大鼠的大脑重量有下降趋势，但差异无显著意义。在PD组中，脑匀浆中SOD和AchE含量明显下降(P<0.01)，而MAO的含量显著升高(P<0.01)，MDA含量无明显变化不大(P>0.05)。与PD组比较，健脑胶囊治疗3组可显著升高SOD和AchE的含量而降低MAO的含量(P<0.01)，提示泼尼松长期应用可导致大鼠脑匀浆生化指标的变化，健脑胶囊可在一定程度上对抗泼尼松的中枢性不良反应。
       2.3  健脑胶囊对泼尼松大鼠脑组织结构影响各组大鼠海马单位面积大锥体细胞数（HN）、大脑皮层厚度（CW）及分子层厚度和皮层的总厚度的比值(M/C)的影响结果见表3。
       表3  健脑胶囊对泼尼松大鼠脑组织结构影响（略）
       各组大鼠大脑外观无显著差异，未见明显的肿胀、萎缩或颜色变化。光镜下可见长期应用泼尼松后大鼠纹状皮质分子层厚度有增加趋势而皮层总厚度(CW)有减少趋势，细胞排列紊乱，部分细胞发生明显水肿，可见有细胞发生明显变性坏死，海马区神经元排列分散，胞体肿胀或皱缩，有较多的神经细胞发生核固缩甚至溶解死亡。与NS组比，长期应用泼尼松后大鼠分子层厚度和皮层的总厚度比值(M/C)上升，海马CA2区单位面积大锥体细胞数（HN）有下降趋势，提示长期超生理剂量使用泼尼松可造成大鼠海马皮层萎缩，神经元细胞肿胀坏死。与PD组相比，健脑胶囊治疗组的大鼠皮层厚度增加，单位面积里神经细胞数目增加，变性坏死的程度也减少，提示健脑胶囊对泼尼松造成的神经细胞损伤有一定的预防作用。
       　　3  讨论
       下丘脑垂体肾上腺皮质轴（HPA）是机体内应激反应的基础，应激反应所导致的超生理剂量的糖皮质激素是加速大脑尤其是海马老化的主要原因。海马是与记忆和思维有关的主要脑区，存在着高密度的糖皮质激素受体，如果体内的皮质激素的含量长期处在平衡失调的状态，则可使海马神经元易于发生应激性反应损伤，导致海马神经元的变性和坏死［3］。三臂电迷宫法是常用的测试动物学习记忆力高低的方法，此法主要是通过观察动物面对危险时所产生的被动和主动逃避反射获得能力和再现能力来判断药物对学习记忆力的影响，在给提示和不给提示的测试中，如果用药动物正确率比非用药动物明显提高，则提示药物具有显著的益智作用，反之亦然。脑组织中MAO，SOD和AchE是与生物体衰老之间关系密切的3种主要的酶。在新陈代谢过程中产生的自由基过量会造成DNA和其他大分子损伤，引起生物体衰老死亡，机体对抗自由基损伤的机制主要有两种，一是对损伤大分子的修复机制，二是消除自由基机制［4］。在体内，最有效的自由基消除剂就是SOD，它的含量降低提示体内过氧化反应明显，机体出现老化现象。MAO可降解脑内的儿茶酚胺含量，使脑活动降低，被认为是老化的标志。乙酰胆碱（Ach）是最古老的递质，其主要功能是作为神经传导的化学递质，在体内的主要灭活方式是靠乙酰胆碱酯酶(AchE)的作用。文献［5］报道在Alzheimer病患者中，发现主要与识别和记忆功能有关的基底前脑中胆碱能神经元发生选择性退行性变，皮层和脑脊液中AchE活性降低。本实验研究中予大鼠超生理剂量的泼尼松灌喂3个月后也观察到大鼠记忆力和反应性下降，海马结构发生改变，神经细胞发生水肿和变性，皮层厚度下降，单位面积里的神经细胞数目减少，单胺氧化酶含量增加，超氧化物歧化酶和乙酰胆碱酯酶减少，提示长期超生理剂量应用泼尼松可造成自由基大量堆积，加速了脑内儿茶酚胺的降解，导致脑神经递质含量紊乱，对大鼠神经系统产生明显的毒性作用。健脑胶囊是由丹参、淫羊藿、黄芪、甘草为主的等几种中药组成的复方，实验研究提示，健脑胶囊对由泼尼松引起的大鼠神经系统损伤具有良好的保护作用，可以明显地提高三臂迷宫的成功率，增加脑匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）和乙酰胆碱酯酶（AchE）的含量，降低单胺氧化酶（MAO）的含量。在健脑胶囊中，丹参是经典的抗衰老的中药，具有镇静安神，改善中枢神经功能的作用，同时丹参可明显改善脑部血液供应以及脑缺血后大脑中单胺类物质的代谢紊乱，对神经递质和血管活性物质也有很好的调节作用［6］，可显著改善神经肽和兴奋性氨基酸的含量以及消除脑中氧自由基的含量 ［7］。 淫羊藿是具有抗衰老作用的药物，在体内可提高SOD的含量，有效清除代谢产生的自由基，对机体有一定的保护作用；另一方面，淫羊藿［8］可增加脑血流量、降低脑血管阻力，从而增加神经细胞的血供，起到保护神经细胞的作用。黄芪具有延年益寿、直接抗衰老作用，可以增加血中和脑中SOD的含量［9］，甘草性平和，有促进各种药效的作用。因此，健脑胶囊对泼尼松大鼠的神经细胞保护作用主要是通过调节神经系统递质的含量，改善脑血供，加速氧自由基的消除等方面而实现的。
       　　参考文献：
       ［1］  Schumacher M,Robel P, Baulieu E.Development and regeneration of the nervous system:a role for neurosteroid［J］. Dev Neurosci,1996,18:6.
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       ［3］  赵  刚，蔡定芳.应激、皮质激素和海马老化［J］.国外医学・老年医学分册，2005，23（3）：125.
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       ［5］  马  强，王  静，刘洪涛，等.体力运动减缓慢性应激对海马的损伤作用［J］.生理学报，2002，54（5）：427.
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       ［7］  王丽娟，李清漪，苏富琴，等.复方丹参注射液对动物学习记忆能力的影响［J］.药物研究，2002，11（9）：28.
       ［8］  韩  冰，杨峻山.淫羊藿药理作用研究概况［J］.中草药，2001，31（11）：9.
       ［9］  李  竞，孔  耕，廖江波. 三七、黄芪、五味子、枸杞对小鼠SOD活性的影响［J］.四川畜牧医学院学报，2001，15（4）：12.
       基金项目：广东省中医药局资助项目（No.2040034）
       （广东医学院，广东  湛江  524023）