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       【摘要】 
       目的研究少棘蜈蚣活性蛋白的纤溶性及其性质。方法通过硫酸铵分段盐析、DEAE纤维素柱和Sephadex G-75柱层析从少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch组织分离纯化出纤溶性活性蛋白，纤维蛋白平板法测定其纤溶性，SDS-PAGE测定样品纯度和分子量，温度、pH改变对少棘蜈蚣纤溶性蛋白活性的影响。结果分离纯化到一种相对分子质量约为48.3 kD的纤溶性蛋白，水解纤维蛋白的比活力为42.36 u/mg。结论少棘蜈蚣活性蛋白具有纤溶性，该成分在40℃下基本稳定，最适温度35℃，最适pH8.0。
       【关键词】  少棘蜈蚣 活性蛋白 分离提取 纤溶活性
       Study on Extraction of Active Protein from Scolopendra subspinipes mutilans and its Fibrinolytic Activity
       LIU Bing,TAN Zhujun*,CHEN Mingjun,LIU Hao,CHEN Yaxiong
       Faculty of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou, 510006,China
       Abstract：ObjectiveTo study the fibrinolytic activity of the active protein of Scolopendra sulspinipes multicans.MethedA novel of fibrinolytic protein was separated and purified by ammonium suplhate sub-precipitation, DEAE-cellulose and SephadexG-75 column chromatography from the tissue of the Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch. ResultThe protein showed an apparent molecular weight of about 48.3kD in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis. Its specific activity to hydrolyze fibrin was 42.36 u/mg. The activity of enzyme was inhibited by serine protease inhibitor such as phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), but wasn" t inhibited by ethylenediaminotetraacetic acid (EDTA). CorclusionThe protein is stable under 40℃, the optimum temperature is 35℃, and the optimum pH is 8.0.
       Key words：Sclopendra subspinipes mutilans L. Koch;  Active protein;  Purification;  Fibrinolytic activity
        蜈蚣属陆生节肢动物，是我国传统的中药材之一。目前蜈蚣药材主流商品为少棘蜈蚣，产量约占95％，少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutitans全虫入药，已有二千多年的使用历史，有熄风解痉、消肿解毒的功能，主治小儿惊风、破伤风、抽搐、口眼歪斜、淋巴结结核、肿毒疮疡等。对其活性蛋白研究有利于进一步探索其药用作用机理，纤溶活性研究为进一步研究其溶栓和抗癌活性奠定基础。
       1   材料与仪器
       1.1  药材
       少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch购自安徽滁州大丰养殖场，由谭竹钧教授对其进行种类鉴定，挑取活体于-80℃冰箱中冻存。
       1.2 仪器
       自动柱层仪(包括梯度混合器、横流器、自动部分收集器、紫外检测仪、小型台式记录仪)，上海沪西分析仪器厂有限公司产品；pH计［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，其精度为±0.01pH］；高速冷冻离心机（KDC-160HR，科大创新股份有限公司中佳分公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；真空冷冻干燥器（LABCONCO，美国）；HHS电热恒温水浴锅（上海博泰实验设备有限公司）；DYY－Ⅲ稳压稳流电泳仪和DYY－Ⅲ28垂直夹芯电泳槽（北京六一仪器厂）。
       1.3 试剂
       Sephadexg-75，台州市路桥四甲生化塑料厂出品；DEAE-32，广东省汕头市西陇化工厂分装；十二烷基硫酸钠（SDS），天津市瑞金特化学品有限公司产品；丙烯酰胺，天津市大茂化学试剂厂产品；考马斯亮蓝R-250、G-250，北京鼎国生物技术有限责任公司产品；牛血清白蛋白（BSA），牛血纤维蛋白原sigma-F8630、凝血酶sigma-T4648，广州宽林仪器科技有限公司产品；尿激酶，中国药品生物制品检定所提供。
       2 方法
       2.1 少棘蜈蚣粗提物的制备［1］
       取-80℃冻死的新鲜蜈蚣16条，4℃冰箱中解冻后称重46.72g，剪刀绞碎于研钵中研磨至糜状，按W/V=1∶5加入预冷的0.02 mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.6)， 4℃冰箱中浸提过夜。4 000 r/min，4℃离心15 min，去沉淀，16层砂布过滤，上清液加固体硫酸铵分段盐析,取35%～70%饱和度盐析组分透析浓缩,得到少棘蜈蚣粗提物。
       2.2 提取物的分离、纯化［2］
       将上述蜈蚣粗提取物用聚乙二醇浓缩后上DEAE-纤维素柱(2.5 cm×45 cm)（预先用0.02 mol/L  pH 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液平衡过夜），用含1 mol/L NaCl的0.02mol/L  pH 8.0 的 Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，流速0.6 ml/min,每管收集6 ml。合并活性峰，透析，冷冻干燥，再上经0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡过的SephadexG-75(1.0 cm×100 cm)柱纯化，用同样缓冲液洗脱，流速为0.2 ml/min, 每管收集3 ml。收集活性峰，冻干备用。用核酸蛋白检测仪检测层析过程蛋白含量，用纤维蛋白平板法进行活力测定。
       2.3 纤溶活性测定
       2.3.1  纤溶平板的制备按照Astrup的方法［3］
       制备纤维蛋白平板，牛血纤维蛋白原、牛凝血酶用0.02 mol/L的Tris-HCl的 (pH8.0)溶解，先配制1.0%的琼脂糖10 ml，煮沸，冷却至50～60℃，加入5 mg/ml的牛血纤维蛋白原0.8 ml及10 U/ml的凝血酶0.5 ml，迅速摇匀，倒入直径9 cm的培养皿中，盖上玻璃盖，冷却凝固（大概5 min）后转移到4℃冰箱保存约30 min。
       2.3.2 去纤溶酶原纤维蛋白平板制作
       将制备好的纤维蛋白平板置80℃处理30 min，使其中纤维蛋白溶酶原全部失活，制成去纤溶酶纤维蛋白平板，可以检验少棘蜈蚣纤溶蛋白是否具有纤溶酶活性。
       2.3.3  纤溶活性的测定
       用0.2 ml枪头在制备好的纤维蛋白平板上打孔，孔与孔之间要保持一定距离，每孔加样品20 μl，以尿激酶为标准品，PBS孔为空白对照组，置37℃培养箱保温24 h。取出用考马斯亮蓝R-250染色10 min，再用脱色液脱色30 min，观察纤维蛋白溶解情况，样品若有纤溶活性会在样品孔周围出现清晰透明的纤维蛋白溶解圈。测量溶圈两垂直直径，计算纤溶圈面积。
       2.3.4  纤溶活性标准
       曲线制作以尿激酶为标准品［4］，PBS液作空白对照。在纤维蛋白平板上作纤溶活性标准曲线，以两垂直直径之积制作标准曲线。计算样品的纤溶活性时将样品的纤溶圈大小对照标准曲线换算成尿激酶单位即可。
       2.4 样品纯度和分子量的测定
       SDS-PAGE浓缩胶浓度为3％, 分离胶浓度为12%,用考马斯亮蓝R-250染色。
       2.5 纤溶活性蛋白浓度测定
       蛋白质浓度采用Bradford法［5］，以BSA为标准作标准曲线。
       2.6 少棘蜈蚣纤溶活性蛋白性质研究［6］
       2.6.1 温度对少棘蜈蚣纤溶活性蛋白活性的影响
       将样品溶液分别置于11组(15～65℃)温度下处理10 min,然后用纤维蛋白平板法测定其酶活力。
       2.6.2 pH对少棘蜈蚣纤溶活性蛋白活性的影响
       将样品溶液稀释于不同pH值缓冲液中(pH6～8用磷酸缓冲液, pH 8.5～10用甘氨酸-NaOH缓冲液, pH10.5～11.5用NaOH调生理盐水后),纤维蛋白平板法测定酶活力。
       3 结果
       3.1 少棘蜈蚣活性蛋白的分离纯化
       少棘蜈蚣粗提物上DEAE-纤维素柱(2.5 cm×45 cm)（预先用0.02 mol/L  pH 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液平衡过夜），用含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L  pH8.0的 Tris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱，流速0.6 ml/min,每管收集6 ml。见图1。
        　　图1  少棘蜈蚣活性蛋白DEAE-纤维素柱层析
       经纤维平板活性检测,峰1无活性，峰2活性大于峰3，峰2少棘蜈蚣活性成分过SephadexG-75(1.0 cm×100 cm)柱纯化。结果见图2～3。经SDS-PAGE检测,电泳图谱显示为一条带，说明得到的少棘蜈蚣纤溶活性成分为单一蛋白,相对分子质量为48.3 kD。
       3.2 少棘蜈蚣活性蛋白纤溶活性测定
       以尿激酶为标准品，PBS液做空白对照在纤维蛋白平板上，以浓度为5，10，15，20，25，30 U/ml的尿激酶标准系列做纤溶活性标准曲线，以纤溶圈面积S(cm2)取对数制作标准曲线(见图4)。测定蜈蚣纤溶活性蛋白比活力为42.36 u/mg。
       3.3 少棘蜈蚣纤溶活性蛋白浓度测定
       测得蜈蚣纤溶蛋白595 nm的吸光度值为0.279，浓度约为80 μg/ml。见图5。
       3.4 温度对少棘蜈蚣纤溶活性蛋白活性的影响
       作用结果见如图6。11组不同温度下其活性变化幅度较大，受温度变化较为敏感，蜈蚣纤溶活性蛋白的最适温度约为35℃。
       3.5 pH对少棘蜈蚣纤溶活性蛋白活性的影响
       作用结果（见图7）在偏碱性环境下蜈蚣纤溶活性蛋白的活性迅速提高，当pH>9时，其活性降低明显，最适pH值为8.0。
       4 讨论
       在提取过程中，通过多次离心避免用无水乙醇去脂，保护蛋白。抑制剂EDTA和PMSF对蜈蚣纤溶活性蛋白活力影响的实验表明，不同浓度EDTA对少棘蜈蚣纤溶蛋白影响不大，表明纤溶蛋白不属于金属酶类；而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF则能完全抑制该蛋白的纤溶活性，表明少棘蜈蚣纤溶活性蛋白可能属于丝氨酸类蛋白酶类［7］。市售纤维蛋白原内常含有少量纤溶酶原，纤溶酶原可在纤溶激酶作用下变为纤溶酶，纤溶酶作用于纤维蛋白后出现纤溶圈，为了探究少棘蜈蚣纤溶活性蛋白的作用机理，将制备好的纤维蛋白平板置80℃处理30 min，使其中纤维蛋白溶酶原全部失活，制成去纤溶酶纤维蛋白平板，以未加热纤维蛋白平板做对照，对照结果发现两个纤溶圈面积相等表明蜈蚣纤溶蛋白本身具有纤溶酶活性。
       【参考文献】
         　　［1］陈少鹏,韩雅莉,郭桅，等.少棘蜈蚣纤溶活性蛋白的抗血栓作用［J］.中国药理学通报，2007，23（8）：1088.
       
       ［2］曾红,张国刚,程巨龙，等.蜈蚣中抗癌活性成分提取［J］.湖南中医杂志,2004,20(5):57.
       
       ［3］Astrup T,Mullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity［J］.Archs Biochem Biophys,1952,40:346.
       
       ［4］李建武.生物化学实验原理和方法［M］.北京:北京大学出版社,1994:216.
       
       ［5］刁劲翩,沈忠耀.用于测定尿激酶原活性的纤溶板法的数字图像处理和分析技术［J］.计算机与应用化学,2001,18(4):343.
       
       ［6］韩雅莉，李张伟.地鳖纤溶活性蛋白的纯化及性质研究［J］.生物工程学报,2006,22(4):639.
       
       ［7］Weon-Kyoo You, Young-Doug Sohn,et al.Purification and molecular cloning of a novel serine protease from the centipede, Scolopendra subspinipes mutilans［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology,2004,34:239.