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       【关键词】  四棱豆；,,总黄酮；,,提取工艺；,,含量
       摘要：目的研究了四棱豆总黄酮的提取工艺和含量。方法采用正交实验分析和分光光度法。结果四棱豆总黄酮的最佳提取工艺是水浴温度为85℃，提取时间为6 h，提取剂乙醇浓度为80%，并且该提取方法稳定性好，精密度和回收率高；以芦丁为对照品，测得四棱豆根、茎、叶、花、果实、种子和整株的总黄酮含量分别为0.73%，0.93%，2.30%，3.96%，2.88%，3.12%和2.44%。结论该研究为四棱豆的综合开发利用提供了科学依据，具有重要的理论和实践指导意义。
       关键词：四棱豆；  总黄酮；  提取工艺；  含量
       Study on the Flavonoid Content in Winged Bean
       QUAN Miaohua ， CHEN Dongming
       (Huaihua Biological College, Huaihua Hunan, 418008，China)
       Abstract:Objective  To study the extraction technology and the content of the flavonoid in winged bean. MethodsThe flavonoid content in winged bean was studied by ultravioletvisible spectrophotometry and the orthogonal experiments. ResultsThe analytical result showed that the optimum extracting conditions were: extracting temperature 85℃,extracting time 6h,extraction reagent 80% alcohol.And the stability of the method was very good,meanwhile the precision and the rate of recovery were high. With rutin as standard material,we drew a conclusion that the total contents of flavonoids in the tuberous roots ,stems,leaves,flowers , tender pods,seeds and the whole plant of winged bean were 0.73%,0.93%,2.30%,3.96%,2.88%,3.12% and 2.44% ,respectively.ConclusionThe study provides a scientific basis for the development of winged bean,and has important guiding significance in both theory and practice.
       Key words：Winged bean;   Flavonoids ;   Extracting conditions;   Content
   
　　四棱豆Psophocarpus  tetragonolobus(L)  DC.，又名翼豆、翅豆、杨桃豆等，是豆科蝶形花亚科四棱豆属的一年生或多年生草本植物。它原产于热带，主要分布在巴布亚新几内亚、印度尼西亚、菲律宾、马来西亚等国家和地区；在我国大部分地区，如云南、广西、广东和海南、湖南、湖北、河南、福建等省区，均可种植栽培。它的根、茎、叶、花、豆荚和种子均含有丰富的营养成分，是一种集食用兼药用的高蛋白作物，其营养价值、经济价值和药用价值已引起世界性的重视和研究，成为许多国家争相开发利用的植物资源［1］。迄今有关四棱豆总黄酮类化合物的含量测定和提取工艺等方面研究未见报道，为充分利用这一植物资源，本文对其开展研究，旨在为四棱豆的进一步综合开发利用提供理论和实验依据。
       　1  材料与方法
       1.1  材料四棱豆种子于200303由中国农业科学院品种资源所提供，先后种植于怀化石门基地、怀化通道基地和怀化学院生物园。该实验材料（根、茎、叶、花、果实和种子）于200510采自于怀化学院生物园，去杂洗净后，置于65℃烘箱中干燥，用微型粉碎机粉碎至60目备用。
       1.2  仪器与试剂 752型紫外可见分光光度计(上海分析仪器总厂)；AL104分析天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；FN1012A型电热鼓风干燥箱(长沙仪器仪表厂制造)；1810B型石英自动双重纯水器（金南仪器厂）；索式提取器。 芦丁标准品（99.99%）（中国药品生物制品鉴定所）；乙醇、NaOH、NaNO2、Al（NO3）3等试剂均为分析纯。
       1.3  方法［2~4］
       1.3.1  最大吸收波长的选择以65%乙醇作为溶剂，以 NaOH，NaNO2，Al（NO3）3作为显色剂，用752型紫外可见分光光度计测定不同光波波长（400~600 nm）下的吸光度，以光波波长为横轴，以吸光度 (A)为纵轴，绘制四棱豆（叶）提取液的吸收曲线。结果见图1。
       1.3.2   提取方法的正交实验方案   在实际操作中，考虑到各种因素之间的影响，因此主要对乙醇的浓度、浸提温度和提取时间三因素四个水平进行正交实验，以便测定不同条件下四棱豆总黄酮的含量。正交实验方案见表1。
       1.3.3  标准曲线的制备准确称取芦丁对照品26.80 mg，用65%乙醇定容至100 ml，即芦丁对照液的浓度为0.268 0 mg/ ml，作为储备液。精确吸取上述储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分别放置于5个25 ml容量瓶中，分别加入5% NaNO2溶液1.0 ml，放置6min后，加入5% Al(NO3)3溶液1.0ml，室温放置6 min后，再加入5% NaOH溶液10 ml，用65%乙醇溶液定容,摇匀，碱性条件下显色15 min后,用1 cm比色皿,以试剂空白为参比,于最大吸收波长（500 nm）处测定吸光度值，绘制标准曲线（如图2）。所得的标准曲线回追方程为 A=6.857・C－0.002，R =0.999 4，线性关系良好，并且由此可推导出公式：C=（A+0.002）/6.857。
       1.3.4   四棱豆总黄酮的测定方法 准确称取四棱豆各器官（根、茎、叶、花、果实和种子）及整株样品各2.000 0 g，用索氏提取器加最适提取剂（80%乙醇）100 ml在85℃水浴温度条件下回流提取6 h，冷却后，用80%乙醇定容至100 ml，备用。准确移取各样品液2组，每份1 ml，置于25 ml容量瓶中，其中一组直接以65%乙醇定容至25 ml作空白对照；另一组按上述方法进行显色测定。
       图1  四棱豆总黄酮的吸收光谱（略）   
       图2  芦丁样品标准曲线（略）   
       1.3.5  精密度实验精密称取干燥的四棱豆（叶）粉末6份，2.000 0 g/份，按1.3.4实验方法测定其吸光度（A）。
       表1  因素水平（略）
       1.3.6  稳定性实验 以四棱豆（叶）提取液为样品液，测定显色液稳定性和提取液稳定性。①显色液稳定性实验：每间隔20 min测1次吸光度，共测定6次；②提取液稳定性实验：每5 d测定1次，共测定6次。
       1.3.7  加样回收率的测定 准确移取上述四棱豆（叶）提取液5份，1.0 ml/份，分别置于5个25 ml的容量瓶中，并且分别加入芦丁标准储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，即分别加入芦丁对照品0.268 0 ，0.536 0，0.804 0，1.072 0，1.340 0 mg。然后按上述显色方法进行比色测定。
       2  结果与分析
       2.1  最大吸收波长由图1可知，四棱豆黄酮提取液硝酸铝显色后稳定的最大吸收峰值在500 nm波长处。因此，芦丁标准曲线及四棱豆各样品黄酮的比色测定均在500 nm波长处进行。
       2.2   正交实验结果与分析  准确称取四棱豆（果实）干燥粉末16份，每份2.000 0 g，分4组，按表2配置方案制备黄酮提取液100 ml，并分别取1.0 ml黄酮提取液置于25 ml容量瓶中，按1.3.3实验的显色方法测定其吸光度。根据表2中R1，R2，R3，R4和 R值分析可知，影响总黄酮提取得率的所选因素的主次依次为提取时间→乙醇浓度→水浴温度，提取四棱豆总黄酮的最佳提取工艺为A3B3C3，即水浴温度为85℃，提取时间为6 h，乙醇浓度为80%。
       2.3   四棱豆不同部位的总黄酮含量比较   分别测定四棱豆各器官及整株的吸光度（A值），3份/样品，取吸光度的平均值（）计算各样品总黄酮的百分含量（W%），并且统计各样品的相对标准偏差（RSD%）。四棱豆不同部位的总黄酮含量比较,详见表3。
       2.4  精密度实验从表4可以看出，6份样品吸光度的平均值为0.124，样品测定结果的精密度较高，重现性较好，其相对标准偏差为1.88%。
       2.5  稳定性实验从表5可以看出，提取液在30 d以内保持基本稳定,其相对标准偏差为2.78%，提取后30 d内的吸光度平均值（0.120）与提取时 (0.124)产生偏差仅为3.23%，说明样品提取液的稳定性比较好；样品显色液在2 h以内保持基本稳定，其相对标准偏差为1.37%，样品显色后2 h内的吸光度平均值（0.122）与提取时 （0.124）产生偏差仅为1.61%，说明显色液的稳定性比较好，同时也说明了测定结果比较可靠，该实验方法可操作性强。
       表2  正交实验与结果（略）
       表3  四陵豆不同部位的总黄酮含量比较（略）
       表4  精密度实验（略） 
       表5  样品稳定性（略）
       2.6  加样回收率的实验 为了精确评价所用方法的准确度，进行了回收实验，结果表明：5个样品的回收率均在95.1%以上（95.1%~98.6%），平均回收率为96.78%。结果见表6。
       　　3  讨论
       3.1  提取工艺通过正交实验分析方法确定了四棱豆总黄酮的最佳提取工艺为A3B3C3，即浸提温度为85℃，提取时间为6h，提取剂乙醇浓度为80%。并且在10~15℃环境温度条件下，该样品提取液在30 d以内保持基本稳定，其相对标准偏差为3.29%，说明样品提取液的稳定性比较好，并且该提取方法简单，效率高，可操作性强。同时，根据提取液稳定性的特点，在进行四棱豆总黄酮的提取加工过程中，可考虑利用提取剂（80%乙醇）在室温下进行较长时间的浸泡抽提，具有重要的参考价值。
       表6  四棱豆总黄酮回收率测定（略）
       3.2  四棱豆总黄酮的含量 通过上述分析可知，采用分光光度法测定四棱豆总黄酮含量时，其提取液硝酸铝显色后最大吸收峰值在500nm波长处，并且首次测得四棱豆根、茎、叶、花、果实、种子和整株的总黄酮含量分别为0.73%，0.93%，2.30%，3.96%，2.88%，3.12%和2.44%，其中花的总黄酮含量最高为3.96%。这为四棱豆具有清热解毒、消炎止痛等多种药用功效，提供了理论依据。同时，四棱豆的适应性强，生长势旺盛，其茎、叶、果实等产量均比较高，并且其黄酮含量也相对较高，具有重要的开发价值。总之，该项目研究不仅初步探明了四核豆总黄酮含量及其提取工艺，而且为四棱豆的综合开发利用开辟了一条新途径，如利用其茎、叶提取黄酮等深加工，开发药物、保健品等，可变废为宝，具有重要的理论和实践指导意义。
       　参考文献：
       ［1］  王佩芝，许冠南，一种有待开发的稀有蔬菜――四棱豆［J］.中国蔬菜，1991，（3）：30.
       ［2］  邓桂春，王  鑫，赵丽艳，等.分光光度法测定银杏叶中黄酮的含量［J］.辽林大学学报（自然科学版），2005（2）：101.
       ［3］  朱  笃，陈飞彪，夏剑辉，等.金鸡菊总黄酮的提取及含量的测定［J］.食品科学，2005（9）：314.
       ［4］  宋元清，王艳平，分光光度法测定莴笋中总黄酮的含量［J］.化学分析计量，2005（4）：52.

　　基金项目：湖南省教育厅科研计划资助项目（No.02C295）
       (怀化学院，湖南 怀化  418008)