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       【摘要】 
       目的观察pH循环后中药五倍子化学成分对早期龋表面形态变化的影响，了解中药五倍子化学成分对人工早期釉质龋的再矿化作用。方法应用离体牛切牙制备人工釉质龋标本60例,随机分为6组：NaF组（阳性对照）、GCE组、GCE-B组、GCE-B1组、GCE-B2组和去离子水组（阴性对照），进行体外pH循环实验后，各组样本分别放入2.5%戊二醛液内固定24 h，4℃，临界点干燥，镀金，扫描电镜下观察。结果再矿化后，NaF组的釉质表面变的比矿化前更加规则、均匀的外观，有许多圆形或椭圆形的晶体颗粒沉积，大颗粒常由数个小颗粒组成，密集、紧奏，略显隆起。GCE组、GCE-B组、GCE-B1组的釉质表面有一层似膜状的结构形成，有一定厚度,进一步观察这层膜结构是由一些呈小球状或不规则的颗粒组成,但外观显得相对不如氟化物组那样规则、均匀。而GCE-B2组釉质表面没有明显的沉积物形成，其外观与去离子水组相似，可见釉柱中心发生脱矿所形成的凹坑。结论五倍子化学成分GCE、GCE-B和GCE-B1具有潜在的促进早期龋再矿化的功效。
       【关键词】  五倍子 有效成分 早期龋 再矿化 扫描电镜
       Effect of Chemical Compounds of Galla chinensis on Remineralisation of Initial Enamel Carious Lesions by SEM in vitro
       CHU Jinpu, HAO Yuqing， LI Jiyao, ZHOU Xuedong 
       1.Department of Cardiology and Endodontology, Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China; 2. Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Ministry of Education , Sichuan University , Chengdu 610041 ,China
       Abstract：ObjectiveTo evaluate the effect of chemical compounds of Galla Chinensis on the remineralisation of initial enamel carious lesions by scanning electron microscope in vitro. MethodsSixty bovine enamel blocks with early lesions were prepared and randomly divided into six treatment groups.The lesions were subjected to the pH-cycling regime for 12 days. Each daily cycle included 4 x 1 min applications with one of six treatments;1,000ppm F aq. (as NaF, positive control); deionized water (negative control); or 4,000 ppm aqueous solutions of four Galla Chinensis extracts (GCEs); GCE, GCE-B, GCE-B1, or GCE-B2. After pH-cycling,the enamel specimens were observed by scanning electron microscope.ResultsThe results showed that there were sediments formed on the surface of carious lesion for the positive control, GCE, GCE-B and GCE-B1 groups except the GCE-B2 group and DDW group. ConclusionGalla Chinensis might be a promising source of non-fluoride anti-caries agents.
       Key words：Galla Chinensis;  Active ingredients;  Initial enamel lesions;  Remineralization;  SEM
       
       龋病是发生在牙齿硬组织的一种慢性细菌性疾病，发病率高，分布广，严重影响人类口腔及全身健康。含氟制剂的使用是目前龋病预防最常用的方法，但氟制剂的使用具有明显的局限性，如氟斑牙、氟骨症等。因此，寻找新的安全、有效的防龋药物越来越受到龋病防治领域学者们的重视。
        近年来中药在龋病防治方面的研究备受关注。本课题组前期研究发现，中药五倍子对口腔中与龋病发生关系密切的细菌有明显的抑制作用［1，2］，尤其五倍子还能促进早期釉质龋的再矿化 ［3～5］。本实验目的是利用扫描电镜(SEM) 观察五倍子处理早期釉质龋后的超微结构，进一步阐明五倍子促进早期釉质龋再矿化的作用机制，为五倍子防龋的推广应用奠定基础。
       1  材料
       五倍子为四川产五倍子Rhus chinesis Mill，由四川省天然药物研究重点实验室提供。其化学组分提取方法为：1 000 g五倍子粉碎，以3 000 ml去离子水于60～70℃水浴10 h，振摇，过滤，滤渣，重复上次操作，合并滤液，加活性炭脱色，过滤，滤液浓缩至稠膏状，加95%乙醇，搅拌溶解，过滤，乙醇液减压浓缩得类白色粉末状物约160 g，为五倍子多酚性化合物—总鞣质(Galla Chinensis extract , GCE)。取GCE 15 g，以葡聚糖凝胶sephadex LH-20为分离材料进行梯度洗脱，葡聚糖凝胶sephadex LH-20 200克装柱，样品以水溶解上样，经30%乙醇1 500 ml洗脱，减压浓缩至干，得GCE-B 2.7 g。将GCE-B（30%乙醇组分）取2 g样品以水溶解上样，洗脱液甲醇∶水（2∶8-3∶7-4∶6），收集，每份30ml,浓缩至干得白色粉末状物——GCE-B1和GCE-B2。经核磁共振氢谱（1H-NMR）、核磁共振碳谱（13C-NMR）的结构鉴定GCE-B1为没食子酸（Gallic acid），GCE-B2为没食子酸甲酯（Methyl Gallate）。
       2 方法
       2.1 釉质的预备
       选择新鲜拔除的牛切牙,除去表面有机污染物，分离冠根, 冠部超声清洗，干燥，体视显微镜下观察无龋损、氟斑、裂痕。用硬组织切割机将牙冠切成5 mm×5 mm×2 mm大小的釉质块，唇面釉质用抛光机及碳化硅砂纸（800#→1200#→2400#）在流水下依次磨平、抛光。选择釉质块60个，超声清洗，自然干燥，釉质块表面开窗4 mm×4 mm大小 ,其余部位涂布两层抗酸指甲油。
       2.2  人工龋实验将预备好的釉质标本
       用嵌体蜡固定在自制的环形玻棒上，放入盛有脱矿溶液［2.2 mmol/L Ca(NO3)2，2.2 mmol/L KH2PO4、50 mmol/L醋酸，1.0 mmol/L NaN3，0.1mg/L NaF，用5 mol/L的KOH调至pH为4.5］的玻璃器皿中，釉质表面与溶液的比率为20 mm2/10 ml，磁搅拌仪搅拌（100 r/min），37℃脱矿3 d。
       2.3 再矿化实验60个人工釉质龋样本
       随即分为6组（10个/组），即：NaF组(阳性对照)、 GCE组、 GCE-B组、GCE-B1组、GCE-B2组，去离子水组(阴性对照)。各实验组药物浓度都为4g/L，用2 mol/L NaOH将pH调至7.0。然后各组分别进行pH循环实验，共循环12 d，其每天的具体方案［5］见表1。表1  再矿化pH循环实验方案（略）
       2.4 扫描电镜观察
       pH循环后，各组样本分別放入2.5%戊二醛液内固定24 h、4℃，临界点干燥，镀金，扫描电镜下观察，工作电压为20KV。
       3 结果
       在扫描电镜下观察,再矿化后，氟化物组的釉质表面变的比矿化前更加规则、均匀的外观，有许多圆形或椭圆形的晶体颗粒沉积，大颗粒常由数个小颗粒组成，密集、紧奏，略显隆起（图1）。GCE组、GCE-B组、GCE-B1组的釉质表面有一层似膜状的结构形成，有一定厚度,进一步观察这层膜结构是由一些呈小球状或不规则的颗粒组成, 其中GCE组相对较厚较多，GCE-B组、GCE-B1组分别次之，但外观显得相对不如氟化物组那样规则、均匀（图2～4）。GCE-B2组釉质表面没有明显的沉积物形成，其外观与去离子水组相似，可见釉柱中心发生脱矿所形成的凹坑（图5～6）。
       4 讨论
          
       五倍子是近年来研究较多的防龋中药之一，本实验室前期研究发现五倍子对牙齿硬组织再矿化具有一定的作用［3～5］。本实验采用体外化学模型—pH循环、通过扫描电镜(SEM)对其化学成分处理早期釉质龋后的超微结构变化进行了进一步观察。
       再矿化是钙、磷和其他矿物离子沉积于正常或部分脱矿的牙釉质内或釉质表面的过程。扫描电镜观察结果证实，经再矿化pH循环后，五倍子GCE组、GCE-B组、GCE-B1组釉质样本表面都有一层似膜状的结构沉积,这层膜结构是由一些呈小球状或不规则的颗粒组成,表明其表面发生了矿物质的沉积，但与阳性对照组（NaF组）比则有明显不同，氟化物组釉质表面有许多圆形或椭圆形的晶体颗粒沉积，比较规则、均匀，说明五倍子与氟化物的再矿化机制可能不同。而GCE-B2组釉质样本表面没有明显的沉积物形成，可见釉柱中心发生脱矿所形成的凹坑，其外观与阴性对照组（DDW组）相似，这证明GCE-B2没有促进早期釉质龋的再矿化。
       再矿化是部分溶解的晶体被来源于溶液中的钙磷离子沉积诱导而增长的过程［6］。五倍子中的主要成分为鞣质及没食子酸。研究证明，鞣酸能与细胞外或组织外的钙离子的络合，形成难溶性的络合物，食物中的鞣酸能影响人体对钙离子的吸收［7］。本实验通过使用Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶从五倍子鞣质GCE中分离得到3个组分： GCE-B、GCE-B1和GCE-B2。经鉴定，GCE-B为GCE去除酚酸聚合体后的小分子多酚性化合物，GCE-B1为没食子酸，GCE-B2为没食子酸甲酯。结果表明， GCE、GCE-B、GCE-B1对早期釉质龋均具有再矿化作用，其再矿化主要发生在表层和表层下，五倍子再矿化的作用机制可能是鞣酸与溶液中的钙离子发生反应形成络合物，通过釉质表面微孔道渗透进龋损内部，促进钙离子沉积，从而引导部分溶解晶体增长促进了再矿化。
       
       通过扫描电镜(SEM)形态学研究再次证明五倍子GCE组、GCE-B组、GCE-B1能促进早期釉质龋的再矿化，其结果与我们以前的研究结果一致。本研究结果从形态学角度进一步阐明了五倍子促进早期釉质龋再矿化的作用机制，为五倍子防龋的推广应用奠定了理论基础。
       【参考文献】
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