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       【摘要】 
       目的研究阴虚内热证红斑狼疮（SLE）患者正常人蛋白质表达谱的差异。方法应用SELDI方法比较15例阴虚内热证SLE患者治疗前与15例健康对照淋巴细胞蛋白表达谱的差异。结果SLE患者治疗前与正常人比较，找出差异表达蛋白峰73个（P<0.05），其中44个峰有非常显著性差异（P<0.01），用ZUCIPDAS软件建立的蛋白质质谱检测模型（10542 Da m/z和2554 Da m/z）的判别率和正确率均为100%，可以通过以上两个峰将SLE与正常人区别开来，10542 Da SLE缺失表达的质荷峰可能是HLA基因家族相关的多个蛋白片段的混合峰，而2554 Da可能是SLE特异表达的未知蛋白峰。结论阴虚内热证SLE治疗前与正常人存在淋巴细胞蛋白表达模式的差异，提示SELDAI蛋白表达谱作为早期诊断SLE的一种方法值得研究。
       【关键词】  阴虚内热证 红斑狼疮（SLE） SELDI
       Difference of the SELDI Protein Peak of Peripheral Blood Mononuclear Cells between SLE with Yin Asthenia Generating Intrinsic Heat and Healthy Control Group
       LAI Meisheng1, FAN Ruiqiang2, CHENG Xiping3
       （ School of TCM, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong, 510515, China;  Guangdong Hospital of TCM, Guangzhou, Guangdong, 510120, China;  Dermatology of the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou, Guangdong, 510120, China）
       Abstract:ObjectiveTo study the differences of protein expression pattern between the Yin asthenia generating intrinsic heat patients with lupus erythematosus (SLE) and normal persons. Methods SELDI methods were used to study the difference of lymphocyte protein expression profile among 15 cases of  SLE patients with Yin asthenia generating intrinsic heat before treatment and 15 cases of healthy controls.Results 73 differentially expressed protein peaks were found between SLE patients and normal controls (P＜0.05), in which, 44 peaks had very significant difference (P＜0.01). Detection model of protein mass spectrometry (10542 Da m/z and 2554 Da m/z) was set up by ZUCIPDAS software with the discriminate rate and accuracy rate as 100%, which could distinguish the sample from SLE and normal persons. 10542 Da  protein expression peak missed in SLE might be the mixed protein fragments peak of HLA gene family, while the 2554 Da protein expression peak might be a SLE-specific unknown protein.Conclusion Different expression patterns of lymphocytes protein exist between the pre-treatment SLE patients with the Yin asthenia generating intrinsic heat and normal controls, suggesting that SELDI protein expression as an early SLE diagnosis method deserves further study.
       Key words:Yin asthenia generating intrinsic heat;  Systematic lupus erythematosus (SLE);  SELDI
        淋巴细胞与各种免疫的发生发展密切相关，研究红斑狼疮（SLE）等免疫相关疾病在疾病的各个环节中淋巴细胞蛋白的表达与修饰的动态变化有重要意义。我们比较研究阴虚内热型SLE与正常人蛋白质表达谱的差异，试图在蛋白水平上了解SLE与正常人的异同，为诊断和治疗提供新的理论指导。
       1  资料
       1.1  病例资料轻中度（5≤SLEDAI≤25）阴虚内热证SLE患者从2005-11～2006-11在广东省中医院门诊就诊的女性患者（年龄在18～50之间）中纳入，总共纳入18例，其中退出2例，失访1例，有效病例共15例。健康对照组来自于广州中医药大学健康大学生和健康志愿者，共15例。纳入、排除、剔除、退出标准参考赖梅生博士论文（《滋阴清热方对阴虚内热证SLE白细胞基因及蛋白表达谱的动态影响》广州中医药大学2007博士论文）。
        阴虚内热证SLE患者15例，均为女性，最大48岁，最小18岁，平均年龄：31.60±9.37；健康对照组15例，均为女性，最大42岁，最小18岁，平均年龄：28.4±6.50。两组年龄经两样本t检验，方差齐性（F＝2.929，P＝0.098），差异无统计学意义（t=1.087，P=0.289）。
       1.2  仪器材料试剂PBS II+ 型 SELDI-TOF-MS，Ciphergen Biosystem Inc. 美国 仪器序列号：2A285TC。常用参数设置：STD SERUM HIGH Spot Production①User name: Administrator.②set High mass to 100，000 Daltons，optimized from 1500 Daltons to 20000  Daltons.③set starting laster intensity to 205. ④set starting detector sensitivity to 8.⑤focus by optimization center.⑥Set mass deflector to 1000 daltons.⑦Set data acquisition method to seldi Quantitation.⑧Set seldi acquisition parameters 21 delta to 3 transients per to 9 ending position to 81.⑨Set warming positions with 2 shots at intensity 210 and Don"t include warming shots.⑩Process sample.
        CM10芯片（弱阳离子交换芯片）：WCX2芯片的改进型，在蛋白质结合区的周围有疏水涂层，使得蛋白质与芯片结合更均匀。每根芯片上有八个直径约2mm的圆形区域，用于结合蛋白质，每个圆形区域结合一份样品。
        Bio-processor：96孔芯片工作平台，Ciphergen Biosystem Inc. U.S.A.
        主要试剂及配制和耗材详见赖梅生博士论文（《滋阴清热方对阴虚内热证SLE白细胞基因及蛋白表达谱的动态影响》广州中医药大学2007博士论文）。
       2  方法
        采用SELDI方法。
       2.1  淋巴细胞总蛋白质提取①取上述分离好的淋巴细胞1管，加入100 μl预冷裂解液 （非变性条件下裂解细胞的裂解液：7M Urea，2 M Thiourea，4% CHAPS，40 mM Tris，2 mM TBP，50 mM DTT，1 mM PMSF），彻底混匀，有效抑制蛋白的降解，在液氮-室温条件下反复冻融3次；②4℃下15 000 r/min离心30 min，收集上清液；③重复步骤②一次，取上清分装于1 ml Eppendorf管2支中，编号冻存于-70℃冰箱保存备用。
       2.2  SELDI方法获得淋巴细胞蛋白质表达谱按表面增强激光解吸时间飞行质谱操作规范寻找合适的分析实验条件。选择美国Ciphergen公司生产PBS-表面增强激光解析-电离时间飞行质谱仪 (surface-enhanced laser desorption/ ionization time- of-flight mass spectrometry， SELDI)及化学蛋白芯片CM10。SELDI操作步骤如下：
       2.2.1  bio rad法测定样品蛋白浓度①用50 mmol/L DTT将胰岛素配成1.5 mg/ml溶液，再稀释成1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.3 mg/ml及0 mg/ml，作为蛋白标准浓度，用于制定蛋白浓度标准方程。②淋巴细胞裂解上清液解冻，加1 μl样品或胰岛素标准浓度测定样品和4 μl  50 mM DTT 溶液于1.5 ml Eppendorf管中，涡旋仪混匀；③加25 μl  RC Reagent I，振荡1 min；④加25 μl  RC Reagent II，振荡5 min，13 000转微型离心机离心5 min，去上清，拍干；⑤加25.5 μl  Reagent A，振荡5 min；⑥加200 μl  Reagent B，振荡15 min；⑦移200 μl 至96孔板中，用BIO-TEK测定吸光度。⑧建立蛋白浓度标准回归方程：Y=8.3527X-1.069，R2=0.893 8。⑨将各样品吸光度值代入计算得出的标准回归方程，得出各样品的蛋白浓度。
       2.2.2  芯片上样①根据浓度梯度，将样品蛋白浓度分为3个级别（0.3～1.0，1.1～3.0，3.1～7.0 ），取样时分别加30，20，10 μl按顺序分别加在96孔细胞培养板孔中，再加10 μl 0.02 mg/ml Insulin/NaAC溶液，然后分别加60，70，80 μl缓冲液平衡(50 mmol/L pH4.0 NaAC)，使液体总体积为100 μl；②将加好样的96孔板置于4℃层析柜中振荡5 min；③芯片预处理：CM10 ProteinChip Array蛋白芯片安装好在Bioprocessor reservoir上，每孔加入200 μl缓冲液(50 mmlo/L pH4.0 NaAC)，放入层析柜中振荡5 min，拍干，重复1次；④将处理好的96孔板中的样品用排枪移95 μl于芯片Bioprocessor加药孔中，放入层析柜中振荡器上振荡反应60 min(250 r/min，4℃)，1 h后甩去孔中未结合的蛋白残液并拍干；⑤200 μl缓冲液 (50mM pH4.0 NaAC)洗3次，振荡5 min/次;⑥加200 μl 去离子超纯水，立即甩干；重复1次；⑦取下96孔Bioprocessor加药器，使芯片自然晾干；⑧加1 μl  EAM 能量吸收剂（50%半饱和SPA）至每个结合点，自然晾干5 min，重复1次，自然晾干，准备上机检测。
       2.2.3  上机检测设定参数：利用Ciphergen公司的PBS-SELDI质谱仪，操作分析软件为Proteinchip Software3.1版。建立数据库目录与路径：D：/重要勿动/JWZ/GDSZYY。激光强度设定为205，灵敏度为8，收集数据的优化范围为1 500～20 000 Da，收集位置21～81，平均每隔3点激发收集9次，共160次。仪器自动得到每个样品各分子量的平均峰值，形成时间飞行质谱。
        数据收集：收集数据前用标准蛋白芯片校正仪器，应用Ciphergen Protein Chip Software3.0提供的过滤噪音工具 biomarker wizard，用每个样品中所含等量的胰岛素的峰值校正不同芯片及不同位点间的差异。将2 000到30 000的质荷比峰首先用信噪比(s/n)大于5过滤，再用信噪比大于2进行第2次过滤。筛出的质荷比峰在10%以上的样本中同时存在，且同一个质荷比峰在不同的样本中的偏差小于0.3 %，以上过程当中去除了原始数据当中的噪音。上Internet网进入Expasy网站等蛋白质数据库比较蛋白点。
       2.3  数据处理与统计分析本实验数据采用浙江大学肿瘤研究所余捷凯设计的ZUCI-PDAS软件包分析。每个样本的原始数据用平移不变小波变换（undecimated discrete wavelet transform)去除噪音，并滤掉基线。过滤掉2 000以下的峰。用局部极值的方法找出样本各自的峰，并过滤掉信噪比小于4的峰。这时从每个样本中找出来的峰的个数及其本身的m/z值都是不同。我们将各个样本中m/z的差异小于0.3％的峰聚为一类。将聚类后只出现在小于10％的样本中的峰去掉。对找出的峰在各个样本中的强度做均一化处理。
        用支持向量机方法建立判别模型，用留一法交叉验证作为评估模型判别效果的方法。支持向量机采用径向基核函数（radial based kernel），Gamma值设为0.6，罚分函数（C）设为19。
        特征向量的选取采用统计过滤结合模型依赖性筛选的方法。对每个质荷比峰做Wilconxon秩和检验，选出p值最小的10个峰进一步分析。将10个峰的任意组合用于支持向量机模型的输入，用留一法评估模型的预测效果，选出建立支持向量机模型预测的约登指数最高的组合作为最终的候选标志物，建立的模型和留一法交叉验证的结果作为最终的结果。
       2.4  蛋白比对分析将SELDI筛选出的蛋白质荷峰（m/z）通过其近似的分子量到Expasy等蛋白数据库进行比对，查找出可能蛋白，再到本次使用的基因数据库中查找，可以将SELDI方法得到的绝大部分荷比峰的蛋白与已知蛋白初步对应起来，从而了解其功能，分析疾病与蛋白的关系。
       3  结果
        SLE患者 (group1)与正常人(group0)比较，找出152个蛋白峰，其中有统计学意义的差异表达蛋白峰73个（P<0.05），其中44个峰有非常显著性差异（P<0.01），具体蛋白峰的相应均值和标准差等统计信息参见表1。表1  SLE患者治疗前与正常人差异表达蛋白峰一览表（略）
        经ZUCIPDAS软件建立蛋白质质谱检测模型（10 542 Da m/z和2554 Da m/z）的判别率为100%，可以通过以上两个峰将SLE与正常人区别开来（参见图1～2）。结果表明，阴虚内热证SLE患者淋巴细胞内蛋白表达模式与正常人存在显著性差异，蛋白表达谱分析有助于诊断SLE，值得进一步研究，可能对早期筛选诊断红斑狼疮有帮助。
        治疗前SLE患者与正常人比较缺失的10 542 Da质荷峰，差异有非常显著性意义（P＝0.000 1），进一步比对治疗中及治疗后SLE与正常人比较所得蛋白峰，我们发现，SLE治疗1个半月时找到10543Da蛋白峰与正常人比较有显著性差异（P＝0.002），而治疗3个月后找到10 546 Da差异蛋白峰（P＝0.045），经基因与蛋白比对分析，我们认为10 542、10 543标志物最可能是HLA基因家族相关的多个蛋白片段的复合物，而10 546标志蛋白最可能是HLA-DPB1 protein（蛋白信息见表2）。
        而2 554 Da在蛋白数据库中找到一个假定蛋白（蛋白信息见表2），功能结构尚不清楚，在基因比对中未找到对应基因，可能是一个红斑狼疮患者发病相关的未知蛋白或多肽片段，有待进一步研究证实。表2  10 542与2554标志物蛋白基因比对结果（略）
       
       4  结论
        SELDI方法观察到阴虚内热证SLE与正常人存在淋巴细胞蛋白表达模式的差异，建立淋巴细胞蛋白表达谱分析可能有助于早期筛选诊断红斑狼疮，值得深入研究。