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       【摘要】 
       目的通过对运动性失眠大鼠进行针刺治疗，探讨针刺疗法治疗运动性失眠的机理和疗效。方法雌性SPF级别SD系列大鼠40只，随机分正常组、对照组、西药组和针刺组，每组10只。针刺组头部百会穴处沿督脉方向进行皮下针刺，西药组注射安定。除正常组外，对照组、西药组、针刺组大鼠进行Y型迷宫、大鼠跑台练习;1周后，在腹腔注射对氯苯丙氨酸。48 h后，采用免疫组化的方法检测大鼠大脑内的c-fos和c-jun含量。结果与正常组对比，所有失眠大鼠大脑内的大脑内的c-fos和c-jun均升高(P<0.05);针刺能够改善失眠，降低失眠大鼠大脑内c-fos和c-jun (P<0.05)。结论针刺疗法可能是通过调节大脑内c-fos和c-jun的表达来治疗运动性失眠，是治疗失眠的理想方法
       【关键词】  针刺疗法; 失眠大鼠; c-fos; c-jun
       睡眠是人类基本的生理需求，良好的睡眠可以促进机体迅速恢复体力和脑力，维持正常的生命节律。大强度的运动负荷对运动员来讲，是一种不良的刺激，运动员在训练和比赛过程中经常会出现失眠现象，称为运动性失眠。它是由运动训练或体育竞赛等相关因素所导致的失眠，引起运动员睡眠的时间缩短。又是导致运动性疲劳的主要原因，从而严重影响运动员的训练质量和运动成绩，并对运动员的身心健康造成很大影响。
       运动员属于特殊群体，采用不当的治疗手段会对运动员的训练和比赛甚至尿检造成影响，我国传统中医针刺治疗手段具有副作用少，疗效好，整体调理性强的特点。运用传统的中医针刺治疗手段进行疗效研究，以减轻运动后失眠现象对运动员的身心健康的影响，提高运动员的训练和比赛成绩，具有重要意义。本文拟从针刺对大鼠大脑内c-fos和c-jun的表达的影响这两个方面探讨中医针刺疗法治疗失眠的机理。
            1 材料
       1.1 动物采用SPF级别SD大鼠40只，雌性，体重(180±50) g,由南方医科大学动物实验中心提供，将所有大鼠按体重编号，并由SPSS生成随机数字，将所有大鼠分成4组，分别是正常组、对照组、西药组和针刺组，每组10只。置于SPF实验室，自由摄食、饮水。室温22℃。保持自然光照，适应性饲养2周，以利环境习服。
       1.2 药品对氯苯丙氨酸(DL-4-Chlorophenylalanine)，由Sigma公司生产，安定由广州陆军总医院购买。实验所需试剂和测试由广州威佳公司提供试剂盒与技术支持;针刺等用品均由广州中医药大学提供。
       2 方法
       2.1 实验过程实验开始第1周，除正常组外，其余3组每只大鼠进行每天15次的Y型迷宫测试，并进行20 min的大鼠跑台(20 m/s),使其在体力和脑力方面达到疲倦。针刺组头部百会穴处皮下针刺沿督脉方向针刺，1次/d，每次留针20 min，7 d后，最后一次针刺结束后，沿督脉方向，以百会穴为中心，皮下埋羊肠线1.5 cm。对照组予安定灌胃，25 mg/kg，灌胃1周。
       1周后，早上8：00开始，将针刺组和对照组大鼠按编号顺序，35 mg/kg腹腔注射对氯苯丙氨酸[1]。并将所有大鼠按分组正常饲养。
       48 h后用10%水和氯醛，麻醉后剖开胸腔，经升主动脉快速灌注37℃生理盐水250 ml，然后滴注含4℃ 4%多聚甲醛的磷酸缓冲液300 ml (pH7.4)，30 min灌流完毕，立即断头取脑，置于上述同样固定液中固定7h，入20%蔗糖液中过夜，在行恒冷箱切片(-20℃)。
       2.2 免疫组化染色0.01 mol/ L PBS中洗10 min，3次，0.3H2O2-PBS液中漂洗15 min，加5%羊血清封闭，37℃孵育30 min，滴加兔抗多克隆fos抗体和兔抗多克隆jun抗体，37℃ 孵育2 h，0.01 mol/ L PBS中洗10 min ，3次,入生物素化羊抗兔IgG (1∶150)孵育1 h (37℃), PBS洗10 min，3次，再入SABC复合物中孵育1h(37 ℃)。PBS洗10 min，3次, DAB显色，重蒸水终止染色10 min,然后脱水、透明、甘油封片。
       2.3 c-fos和c-jun阳性细胞计数每例脑标本特定部位选取3张切片，定点计数5个高倍视野，在显微镜下(10 ×10倍) ，观察5个视场的阳性细胞。对c-fos和c-jun阳性细胞显微镜下计数，计数相应区域同一视野(海马区)，相同面积内阳性细胞数，取平均值进行统计学分析。
       2.4 统计分析对所测试指标进行单因素方差分析。主要采用SPSS13.0进行。
       3 结果
       实验结果表明， 与正常组对比，所有失眠大鼠大脑内的c-fos、c-jun水平均降低(P<0.05)，提示c-fos、c-jun可以减轻失眠的发作,对失眠大鼠大脑具有保护作用。针刺能够降低失眠大鼠大脑内c-fos和c-jun水平(P<0.05)。针刺可能通过癫痫大鼠大脑内的c-fos和c-jun水平而减轻失眠的发作，对失眠大鼠大脑具有保护作用;与对照西药相比，差别无显著差异(P>0.05)，是治疗失眠的理想方法。表1 c-fos细胞数(10×10，0.01 mm2)与正常组比较，*P<0.01;与对照组比较，#P<0.05表2 c-jun细胞数(10×10，0.01 mm2)
       4 分析与讨论
       睡眠不仅具有维持个体生存的功能，还有促进生长发育、易化学习、形成记忆的功能。有实验证明，睡眠对随后的学习非常重要，预先睡眠剥夺48 h后，学习能力下降，而且睡眠对于复杂事物的固化是非常必要的，对于简单事物则非必需。对于运动员群体尤为重要。睡眠剥夺可引起情绪、学习记忆、免疫功能等一系列改变。睡眠与觉醒所涉及的神经机制非常复杂，多种神经递质参与睡眠与觉醒生理周期的调控。
       c-fos、c-jun和失眠的关系[2]： 在接受了外界信息后最先被活化的基因是即刻早期基因(IEG)，包括c-fos、c-jun、c- myc 、c-myb 等，它们参与细胞生长、发育、分化、学习、记忆和信息传递等生理过程。大量资料表明，在正常情况下，c-fos、c-jun蛋白在神经细胞中有低水平表达;在各种化学和电刺激所造成的失眠活动中[3，4]，c-fos及其蛋白产物可作为神经元兴奋的标志和细胞内信息传递的第三信使，形成异源二聚体作用于靶基因(迟反应基因L R G)调控序列中的AP-1位点，从而激活LRG, LRG的表达产物使神经网络的兴奋性和神经元的固有成分发生改变，如GABA释放减少，谷氨酸释放增加以及神经元的出芽等，最终导致神经网络的兴奋抑制平衡遭到破坏形成失眠。c-fos蛋白的表达程度和失眠所致的神经突触的活跃程度相关。
       针刺疗法是我国传统的中医疗法，在治疗失眠有独到的疗效。由于运动性失眠的特殊性和运动员的特殊性，采用针刺治疗失眠，具有安全性高、疗效显著、无任何副作用、不存在药检影响等特点。实验以对氯苯丙氨酸为模型研究针刺作用的分子生物学机制, 笔者发现用失眠大鼠海马区c-fos蛋白和c-jun阳性细胞计数明显增多。采用针刺埋线预防治疗，大鼠海马阳性细胞计数明显低于模型组，且中药组镜下细胞无异常改变。针刺可以使失眠大鼠皮层与海马的c-fos 和c-jun表达减弱，阳性细胞数减少，其机制可能与降低脑内c-fos 和c-jun基因表达有关。推测其治疗失眠机制可能与降低c-fos 和c-jun基因的表达，影响哺乳动物中枢神经系统内氨基酸类神经递质的比例和含量，对神经元的活动及相关联系分别具有兴奋-抑制性调控作用，从而起到调节睡眠的作用。
       【参考文献】
         　　[1] 全世建，林杏娥.PCPA大鼠失眠模型的证候属性研究[J].中医药学刊，2006，24(3):450.
       
       [2] 陈 杰,冯 超,宋建宁.c-fos原癌基因在脑缺血应激反应中作用的研究[J].医学综述，2008,14(1):56.
       
       [3] 宋国萍，苗丹民，皇甫恩,等，连续及部分睡眠剥夺96小时后大鼠脑干中c- fos蛋白的表达[J].中国临床心理学杂志，2003,11(1):9.
       
       [4] 吴振宇，张 云.心理应激性失眠大鼠中缝背核神经元超微结构及加味逍遥散的影响[J].中国行为医学科学,2007,16(11):961.