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       【摘要】 
       目的建立体外抑制乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase ,AchE)活性实验方法，探讨石菖蒲抑酶活性及活性部位。方法提取制备石菖蒲根和叶的乙醚、醋酸乙酯及正丁醇萃提液，以石油醚-醋酸乙酯(85∶15)为展开剂，对石菖蒲根和叶的乙醚萃提液层析分离后进行抑制AChE活性试验，采用分光光度法分别测定石菖蒲根和叶醋酸乙酯及正丁醇萃提液的AChE抑制率。结果石菖蒲根和叶的挥发油在薄层板显示有显著抑酶斑点，石菖蒲根和叶的乙醚萃提液薄层色谱中与α-细辛醚和细辛醚对应的显著抑酶斑点比移值为Rf0和Rf (0.64±0.01)[t=(17±2)℃];石菖蒲根和叶的醋酸乙酯及正丁醇萃提液酶抑制率分别为39.17%，18.45%，24.33%和1.74%;石菖蒲根的水溶液无明显抑酶斑点但测定仍有较弱酶抑制率，石菖蒲叶的水溶液无抑酶斑点且两者均显示蓝色斑点。结论石菖蒲根和叶的挥发油具较强抑制AChE活性，其中α-细辛醚为强抑酶活性成分，石菖蒲根醋酸乙酯和正丁醇萃提液抑酶活性分别较石菖蒲叶强，石菖蒲根水溶液有微弱抑酶活性而叶的水溶液无抑酶活性，但两者的水溶液均有酶促作用的成分。该法作为一种体外抑酶(AchE)活性实验， 结果与文献报道的体内抑酶实验一致
       【关键词】  石菖蒲; 体外; 乙酰胆碱酯酶; 抑酶活性; α-细辛醚
       Research on Inhibitory Effect of Acorus tatarinouii Schott on AChE Activity in Vitro
       JIN Hong , XU Guobo, HUANG Yi
       (College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology ,Mianyang 621010, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the inhititory effect of Acorus tatarinouii Schott and its active part.MethodsThe solutions of roots and leaves were prepared from Acorus tatarinouii Schott with ether, acetic ether and n-butyric alcohol.The experiments of AchE inhibition was done by TLC for ether solution of root and leaf,the solvent system was petroleum ether- acetic ether(85:15). Determination of the AchE inhibition percentage was established for acetic ether and n-butyric alcohol solution of root and leaf by spectrophotometry. Results The volatile oil of root and leaf from Acorus tatarinouii Schott was marked white spot on TLC. There was marked white spots on TLC in ether solution of root and leaf, which was corresponding with α-asarone and reference volume were 0、0.64±0.01(t=17±2℃).The AchE inhibition percentage of effective parts in root and leaf from Acorus tatarinouii Schott after extraction by acetic ether and n-butyric alcohol were 39.17%、18.45%、24.33% and 1.74%.There was no marked white spot on TLC in water solution of the root and leaf but root"s AchE inhibition percentage was 1.20% . There was blue spot .ConclusionThe volatile oil of root and leaf from Acorus tatarinouii Schott has strong inhibvtiry effect on AchE activity and α-asarone was strong active substance. The activity of AchE Inhibtion of root extraction by acetic ether and n-butyric alcohol was stronger than leaf.The water solution of the root has weaker activity of AchE inhibition and the leaf has not. Both root and leaf have active substances of AchE promoter in their water solution.A new way to test the AchE inhibition in vitro is established and it reaches a consistent result in vivo.
       Key words：Acorus tatarinouii Schott ; In vitro; AChE; Activity of AChE inhibition; α-asaron
       石菖蒲为天南星科石菖蒲Acorus tetarinouii Schott.的根茎,始载《神农本草经》，其“开心孔,补五脏,通九窍”，被历代本草列为上品[1]，主产于四川、浙江和江苏，是为数不多的芳香开窍中药之一。近年来大量药理研究表明石菖蒲能益智、抗抑郁，对心血管系统神经-内分泌-免疫网络系统等具有广泛作用[2～ 4]，在传统应用治疗老年痴呆中药复方中石菖蒲使用率较高[5，6 ]，但有关其对脑和神经系统中受体功能、神经递质、神经生长因子等方面作用机理的研究目前还十分有限。该实验对石菖蒲根和叶的不同溶剂萃取部分，通过薄层色谱及分光光度法进行了体外抑制乙酰胆碱酯酶活性及部位的初步研究，以进一步结合体内实验探讨石菖蒲影响乙酰胆碱神经递质的作用机理。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器设备WFJ7200型分光光度计;WS70-1型红外线快速干燥器;5801R冷冻离心机(epperdorf);FZ103型植物粉碎机;SB-2型薄层色谱仪;PHS-3C型精密酸度计;DS-1高速组织捣碎仪;W201B恒温水浴箱;挥发油提取器。
       1.2 试剂与材料醋酸β-萘酯(上海试剂厂)，fast blue B salt(SIGMA-ALDRICH.Inc)，层析硅胶G(青岛海洋硅胶干燥剂厂)，α-细辛醚对照品(中国药品生物制品检定所，批号：10298-0001)，细辛醚原料(广西亿康药业有限公司，批号060701);乙醚、无水乙醇、醋酸乙酯、正丁醇均为分析纯;昆明种二级小鼠[平均体质量(20±2)g]购于四川大学实验动物中心;石菖蒲Acorus tatarinouii Schott.采自四川省射洪县香山镇，市售石菖蒲药材购自太极集团绵阳天诚大药房，由西南科技大学生命学院金虹副教授鉴定。
       2 方法与结果
       2.1 酶试液的制备取小鼠1只(雌雄不限)，依法操作[7]，制备酶试液备用。
       2.2 底质溶液的配制临用时取醋酸-β-萘酯溶液(醋酸-β-萘酯25 mg加无水乙醇溶解定容于20 ml)与牢固蓝B(fast blue B salt)试液(牢固蓝B 20 mg加16 ml水溶解)，按1∶4(V/V)混合。
       2.3 样品制备
       2.3.1 药材处理 将采集的石菖蒲洗净晾干，剪断为根和叶两部分，低温干燥，分别粉碎成粗粉备用，石菖蒲药材粉碎后过40目筛，备用。
       2.3.2 样品提取取石菖蒲根和叶粗粉约20 g，分别置挥发油提取器，加水150 ml提取约1 h，静置冷却提取液。
       2.3.3 样品液制备分别将上述石菖蒲根和叶挥发油提取液置分液漏斗，各加乙醚10 ml萃取，分取乙醚层;将剩余液依次分别用醋酸乙酯和正丁醇各10 ml分2次萃取，合并萃取液，即得①石菖蒲根乙醚液，②石菖蒲叶乙醚液，③石菖蒲根醋酸乙酯液，④石菖蒲叶醋酸乙酯液，⑤石菖蒲根正丁醇液，⑥石菖蒲叶正丁醇液，⑦石菖蒲根水层液，⑧石菖蒲叶水层液;石菖蒲药材样品液制备按资料[7]操作。
       2.3.4 对照品液制备精密称取α-细辛醚和细辛醚原料适量，分别加乙醚溶解，制成1 mg·ml-1的溶液。
       2.4 抑酶活性预实验用微量点样器吸取样品液①～⑧各10 μl, 点于普通硅胶G-CMC板,按酶抑制法[8]试验, 结果①②白色斑点极明显，③④白色斑点较明显，⑤⑥白色斑点不明显，⑦⑧无白色斑点且显蓝色斑点。
       2.5 薄层分离抑酶实验
       2.5.1 薄层层析取2块硅胶G-CMC板，平行操作，分别吸取样品液①和②各10 μl, α-细辛醚和细辛醚对照液各5 μl，点于同一硅胶G-CMC板, 其中1块点石菖蒲药材液， 置层析缸中,以石油醚-醋酸乙酯(8.5∶1.5)为展开剂，饱和10 min后上行展开,完毕，取出自然挥干溶剂，不点石菖蒲药材液的板喷5%的香草醛硫酸溶液显色。结果见色谱图1。其中样品与α-细辛醚对照品在Rf0和Rf (0.65±0.02)斑点一致，样品与细辛醚在Rf0和Rf( 0.65±0.05)斑点一致。
       2.5.2 酶抑制实验取上述薄层层析后未显色层析板，按酶抑制法[8]试验。结果见图2。其中样品与对照品在Rf0、Rf (0.65±0.02)和Rf (0.65±0.05)有对应抑酶斑点。
       图1 薄层色谱图(t=17±2℃) 图2 抑酶色谱图
       2.6 酶抑制率测定
       2.6.1 吸收曲线 取“2.1”项酶试液加去离子水(-4℃冷藏)稀释(1→10 ml),精密吸取稀释酶试液1 ml于试管，置37℃的恒温水浴中放置20 min，取出立即加入底质溶液2 ml，振摇均匀，以去离子水为空白，作吸收度扫描。结果见图3。在λ(540±1)nm波长处有最大吸收。
       图3 AchE反应生成物吸收曲线
       2.6.2 酶抑制率测定按“2.4”项操作，将石菖蒲根和叶依次以乙醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取后溶液作为样品I，II，III，IV，V，VI。分别取样品1.0 ml于试管，各精密加入稀释酶试液1 ml，置37℃的恒温水浴中放置20 min，取出立即加入底质溶液2 ml，取离子水1.0 ml精密加入稀释酶试液1ml平行操作为对照，去离子水为空白，在λ(540±1)nm处分别测定吸收度，按公式：酶抑制率(%)= (对照管吸收度 - 样品吸收度)/对照管吸收度×100%计算。结果见表1。表1 酶抑制率测定结果
       3 讨 论
       实验采用薄层抑酶定性及比色法定量的方法，对石菖蒲根和叶进行了体外抑酶活性成分筛选及活性部位酶抑制测定。定性及定量实验结果均表明石菖蒲具有抑制乙酰胆碱酯酶作用，该结论与石菖蒲不同提取部位降低乙酰胆碱酯酶活力[9]的体内实验报道一致，说明了该方法作为一种体外抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)活性筛选试验的可行性和准确性。
       薄层实验结果显示石菖蒲根分离出的色谱斑点较其叶多，其中除α-细辛醚抑酶斑点外，还有另外两个抑酶斑点，表明石菖蒲根和叶化学成分的差异，此外α-细辛醚与细辛醚在薄层色谱和抑酶斑点的Rf值均有差异，可根据β-细辛醚和γ-细辛醚对照品进一步确定样品对应斑点的化学成分，同时石菖蒲除挥发油中已知成分达三十个以上，还有多种水溶性及其它成分[10]。因此该实验中石菖蒲其他活性部位的化学结构类型以及根和叶水溶性部分增色现象缘何物质，均需通过多种分析方法作出判定。
       实验结果显示石菖蒲根各提取部位抑酶活性均较叶强，表明其根活性成分较叶高，与根入药的传统用法相符，且酶抑制率测定结果表明石菖蒲根经正丁醇萃取后的水溶液仍有微弱的抑酶活性，即石菖蒲根水溶性部分有抑酶活性成分，定量测定结果与前期定性筛选实验相吻合[7]。
       实验表明石菖蒲中挥发油和细辛醚有较强抑制乙酰胆碱酯酶活性，由此推测石菖蒲能提高乙酰胆碱神经递质的水平，这是否成为石菖蒲治疗老年记忆减退和益智作用的又一机理，还有待进一步实验证明。
       【参考文献】
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