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       【摘要】 
       目的探讨解毒化瘀颗粒抑制急性肝衰竭小鼠肝细胞凋亡的作用及可能的机制。方法将昆明小鼠随机分为空白组、模型组、解毒化淤颗粒组、安宫牛黄丸组、乳果糖组，用D-GalN+LPS腹腔注射构建急性肝衰竭的小鼠模型，观察各组小鼠存活率，SYBR荧光实时定量PCR法检测肝细胞内天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3 mRNA)的表达。结果成模后48 h存活率解毒化淤颗粒组高于其他药物组;促凋亡因子Caspase-3在解毒化淤颗粒组肝组织中表达量低，而在其他药物干预组及模型组中则高表达。结论急性肝衰竭中Caspase-3表达与肝细胞凋亡程度有相关性，解毒化淤颗粒能下调内毒素肝损伤肝细胞Caspase-3表达并抑制其凋亡效应，降低肝衰竭小鼠死亡率，提示解毒化淤颗粒抑制肝细胞凋亡有可能是其防治急性肝衰竭的机制之一。
       【关键词】  解毒化瘀颗粒; 急性肝衰竭; 细胞凋亡; SYBR荧光实时定量PCR
       Effect of Jieduhuayu Granule on the Expression of Caspase-3mRNA in Liver Cells of Acute Liver Failure Mice
       MAO Dewen,CHEN Yueqiao,YU Jin,HUANG Guye,WANG Li,LONG Fuli
       ( First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University ,Nanning, Guangxi 530023,China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Jieduhuayu granule on hepatocyte apoptosis in acute liver failure mice and its possible mechanism.MethodsKunming mice were randomly divided into blank control group, model group, and Jieduhuayu treating group. Acute liver failure was built with D-GalN+LPS intraperitoneal injection to the mice. The survival rate was observed and the expression of Caspase-3mRNA was tested with SYBR fluorescence real-time quantitative PCR assay.ResultsAfter 48 h,the survival rate in Jieduhuayu treating group was higher than that of other drug treating group;at the same time pro-apoptotic factor,Caspase-3 expression in liver tissue is low in the Jieduhuayu particle group but high expression in other drug treatment groups.ConclusionThe Caspase-3 expression is related with hepatocyte apoptosis in acute liver failure.Jieduhuayu treatment granule can reduce liver cell injury by through inhibiting the expression of Caspase-3,and reducing mortality rate of liver failure mice.
       Key words：Jieduhuayu granule; Acute liver failure; Apoptosis; SYBR fluorescence RT-PCR
       急性肝衰竭病情重预后差,其发病机制目前尚不十分清楚。临床上虽有药物和人工肝等各种治疗措施,但病死率仍高达60%～80%[1]。近来研究发现, 肝细胞凋亡是病毒性肝炎及肝衰竭的重要发病机制之一，细胞发生凋亡的中心环节是激发了以蛋白酶组成的级联反应，而Caspase-3 处于核心位置，在细胞凋亡过程中起着关键作用[2]。因此，干预肝细胞凋亡的发生在防治急性肝衰竭的研究中有重要的临床意义。解毒化淤颗粒是我院用于治疗肝衰竭的复方中药制剂，近年用于肝衰竭的治疗也取得了较好的效果，但其作用机制尚未清楚。本文从动物实验方面观察了Caspase-3 基因在 D-GalN+LPS 所致急性肝衰竭小鼠肝细胞中的表达和肝细胞凋亡情况，探讨Caspase-3 基因表达在急性肝衰竭肝细胞凋亡中的意义及解毒化瘀颗粒拮抗肝细胞凋亡的机理。
       1 材料与仪器
       1.1 动物 昆明小鼠160 只，体重(20±5)g，SPF 级，雌雄各半，由广西食品药品检验所实验动物中心提供(动物生产许可证号： SCKX桂2003-0001、0002)。
       1.2 药物 解毒化淤颗粒(茵陈30 g，赤芍50 g，大黄15 g ，白花蛇舌草30 g，郁金15 g，石菖蒲15 g等)由单味中药浓缩颗粒剂配制而成(由江阴天江药业有限公司提供，产品批号 07004160);乳果糖(由荷兰Solvay Pharma 公司提供，产品批号：331307，进口注册号:h20030303);安宫牛黄丸(由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂提供，批准文号：国药准字Z11020076，产品批号：6017014)。
       1.3 试剂 造模剂：氨基半乳糖D-GalN[D-(+)-Galactosamine hydrochloride](由sigma公司提供，产品批号：G0500)，内毒素脂多糖LPS(lipopolysacchar-rides，由sigma公司提供，产品批号：L2880 cat.No.L8880)。SYBR荧光实时定量PCR:总RNA抽提试剂Trizol为Invitrogen公司产品，反转录试剂盒SuperscriptTMⅡRnase H-Reverse Transcriptase为Epicentre公司产品，LightCycler-FastStart DNA Master SYBR GreenⅠ试剂盒为Roche公司产品、dNTP、Oligo-dT为上海生工生物工程有限公司公司产品，Rnasin、DTT、pMD 18-T Vector为Epicentre公司产品。
       1.4 仪器 DU-640型蛋白核酸分析仪(美国Back-man公司);5417R型低温高速离心机(德国Eppendorf公司); JY92-2D型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所);ST-Ⅱ型大型半干式转移电泳槽(大连竞迈生物科技有限公司 );MV-ILA型小型双垂直板电泳槽(大连竞迈生物科技有限公司 );Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems)。
       2 方法
       2.1 动物模型制作采用腹腔联合注射D-GalN+LPS致急性肝衰竭小鼠模型,方法参考张磬等[3]的方法，使用前用生理盐水将D-GalN配置成的1G/100 ml的溶液,再用1 mmol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.1～7.2。LPS用无菌生理盐水配成1 μg/6ml,过滤除菌。注射量为D-GalN 600 mg/kg体重与LPS10 μg/kg体重。
       2.2 动物分组及给药160只SPF级昆明小鼠,随机分为空白组(16只)、模型组(36只)、解毒化瘀颗粒组(36只)、乳果糖组(36只)、安宫牛黄丸组(36只)。雌雄各半。各药物组均取20只用于观察死亡率。
       解毒化淤颗粒组给予57.55 g生药/kg，乳果糖组参照文献[4]给予3.5 g/kg，安宫牛黄丸组参照文献[5]给予1.5 g/kg。使用时,用蒸馏水将解毒化淤颗粒的配方颗粒剂配成0.417 7 g/ml,乳果糖配成0.175 g/ml，安宫牛黄丸配成0.075 g/ml，正常组与模型组分别给予蒸馏水代替，每天灌胃量0.2 ml/10g体重。造模前5 d开始灌胃给药，2次/d，间隔12 h，共给药5 d。实验过程中，动物均饮用生理盐水葡萄糖液。
       2.3 标本保存与处理成模6 h后各组随机取存活小鼠16只处死, 1 min内切取新鲜肝左叶,在冰块上以PBS缓冲液清洗干净,切取0.5 ～ 1.0 mm3 大小的肝组织块,立刻放入液氮中冷冻。其余存活小鼠用于成模后48 h 存活率统计。
       2.4 检测指标及方法
       2.4.1 成模后48h存活率观察观察各组小鼠腹腔注射D-GalN和LPS后外观、皮毛、肤色、呼吸、行为活动、精神状态、食欲、大小便及鼻、眼、口腔有无异常分泌物等变化,并准确记录出现死亡的时间、数量、性别分布等情况。
       2.4.2 SYBR荧光实时定量PCR法检测Caspase-3mRNA
       肝组织总RNA的提取：取冻存的肝组织约0.1g,采用Trizol提取组织的总RNA,操作按说明进行。提取后的RNA测A260-A280吸光值,要求A260～A280比值为1.8～2.1,并计算出RNA含量?
       cDNA的合成：配制退火混合物:RNA 3 μg;0.5 μg/μl Oligo(dT)18,1 μl;加无RNA酶的H2O至总体积10 μl。混合液在70℃水浴3 min,降到37℃放置10 min。RT反应液:10 × RT缓冲液2 μl;2.5 mM dNTP混合液4 μl;RNA酶抑制剂1 μl; MMLV反转录酶1 μl;混合后37℃恒温1 min。加10 μl的RT反应液到10 μl退火混合物中,37℃水浴60 min,加热到95℃维持5 min。得RT终溶液即为cDNA溶液,置冰浴待用。
       定量模板的克隆和制备及引物：以cDNA为模板,加入相应引物及SYBR Premix Ex TaqTM,分别对Caspase-3和内参(β-actin)进行扩增，从Genebank中调出Caspase-3的DNA和RNA序列,根据引物设计原则,设计双向引物序列,所需引物序列如下:F:5"GTCTGACT GGAAAGCCGAAAC3";R:5"GGGACTGGATGAACCACGAC3";退火温度:59℃,产物长度:207 bp;β-actin:F:5"CCTCTATGCCAACACAGTGC3",R:5"GTACTCCTGCTTGCTGATCC3",退火温度:58℃,产物长度:211 bp。
       SYBR GreenⅠ实时定量PCR：荧光定量PCR反应中Caspase-3基因反应参数为:95℃,5min;35个PCR循环;beta-actin:95℃,5 min;30个PCR循环,将定量模板进行10倍梯度稀释,得到不同浓度的标准模板10-1～10-9,制作caspase-3和内参标准曲线;再将待测样品与标准品同时在荧光定量PCR仪上反应,所得不同Ct值分别代入不同标准曲线,电脑自动读出各样品起始模板量。将各样品Caspase-3基因定量结果与内参基因定量结果相比进行RNA校正,即可得到各组小鼠肝组织中Caspase-3mRNA的相对表达量。
       PCR产物的确定分析：将所扩增的PCR产物同时进行琼脂糖凝胶电泳及熔解曲线分析。程序选择熔解曲线。
       2.5 统计学处理采用SPSS for Windows13.0统计软件,各组之间阳性率的差异采用适合小样本的Fisher 确切概率法,计量资料数据以±s表示,组间差异采用ANOVA分析和LSD-q检验。双侧P≤0.05认为有统计学意义。
       3 结果
       3.1 解毒化淤颗粒对急性肝衰竭小鼠成模后48h存活率的影响各组小鼠在腹腔联合注射D-GalN+LPS 4 h内一般无小鼠死亡;6 h后肝衰竭组小鼠开始出现神志昏迷症状,部分小鼠出现球结膜水肿、抗捕能力完全消失,四肢轻微震颤,甚至部分出现痉挛或抽搐,并开始出现死亡现象,取血部位凝血障碍。比较48 h各组小鼠存活率发现，解毒化淤颗粒、乳果糖、安宫牛黄丸均能提高肝衰竭小鼠的存活率,与模型组比较P<0.05。药物组间比较，解毒化淤颗粒组>乳果糖组>安宫牛黄丸组(P>0.05,可能与样本量太少有关),雌雄间无明显差异性。结果见表1。表1 成模后48h存活率观察结果
       3.2 荧光定量RT-PCR检测Caspase-3mRNA结果
       3.2.1 熔解曲线与假阳性荧光定量PCR产物的熔解曲线SYBR Green 荧光染料分子掺入引物二聚体、单链二级结构、非特异性产物也会发出荧光信号,因此在实验中必须避免引物二聚体、单链二级结构、非特异性产物的存在。需要测定产物的熔解曲线来分析产物的均一性,若产物中只含有特异性产物,则其熔解曲线表现为单一的峰值,结果表明,Caspase-3基因 PCR产物只有单峰,说明扩增产物单一,避免了定量检测过程中假阳性结果地出现。结果见图1a～b。经琼脂糖凝胶电泳证实为目的条带。结果见图2。
       3.2.2 扩增曲线与灵敏性 利用梯度稀释的标准品做阳性模板进行实时荧光定量PCR反应,可得到模板循环数与荧光强度关系。结果见图3a～b,其中横坐标代表PCR反应的循环数,纵坐标代表双链与SYBR Green荧光染料结合后的荧光强度(F1),从图中可以看出不同拷贝数的模板随循环数的增加,其荧光强度逐渐增强,在经过一段指数扩增后曲线趋于平行,即出现“平台效应”,指数扩增期模板拷贝数与荧光累积值的一一对应关系形成了Caspase-3定量的基础。从扩增曲线图可见实时荧光定量PCR检测凋亡蛋白Caspase-3具有较好的敏感性。
       3.2.3 标准曲线以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标,以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到Caspase-3的标准曲线,为待测样品的Caspase-3定量提供了定量检测的参照标准。结果见图4a～b。
       3.2.4 样品Caspase-3 mRNA的定量结果 各组Caspase-3 mRNA定量结果见表2。正常组小鼠肝组织Caspase- 3的表达很少,与正常组比较,模型组小鼠肝组织Caspase- 3 mRNA表达显著增加(P< 0.01)，与模型组比较,解毒化瘀颗粒组、安宫牛黄丸组以及乳果糖组Caspase-3 mRNA表达显著降低(P<0.01),与解毒化淤颗粒组比较,安宫牛黄丸组以及乳果糖组表达增加(P<0.05)。表2 各组小鼠荧光实时定量结果
       4 讨论
       近来研究已证实,Caspase参与Fas系统和肿瘤坏死因子(TNF)等细胞凋亡信号转导网络的传递过程。在凋亡实施期,活化的Caspase触发酶级联效应,最终引起染色体DNA的降解和细胞的解体。Caspase-3是凋亡级联反应的一个重要执行者,它的过量表达可诱发细胞凋亡,在凋亡的执行阶段,负责对全部或部分关键性蛋白的酶切从而引起凋亡的激活。因此,许多学者将活化Caspase-3蛋白酶的出现作为细胞凋亡的标志。
       Caspase-3主要负责切割某些蛋白质。其对底物作用引起的变化包括:①引起细胞周期阻滞;②破坏细胞平衡状态及修复机制;③使细胞从周围的组织结构中脱落;④使维持细胞结构的物质解体。大多数触发细胞凋亡的因素,最终均需要通过Caspase-3介导的信号传递途径导致细胞凋亡。Caspase-3可通过Fas介导的死亡信号途径, 降解凋亡抑制蛋白Bcl-2,被Caspase家族上游成员激活并水解为活性酶形式,形成级联反应,催化参与DNA修复的PARP,即聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase]的裂解,同时DFF、CAD等核酸内切酶的活化,使DNA在核小体连接处被切割,产生成倍于180～200bp大小的DNA片段[6，7]。进而裂解细胞的关键结构蛋白和看家蛋白(如细胞外基质蛋白、骨架蛋白、核蛋白及相关蛋白如actin、spectrin、PAK2等), 使细胞失去正常形态,位于细胞-细胞、细胞-细胞外基质接触位点上的VMEKK-1、FAK等蛋白激酶失活,使细胞失去与环境之间的联系,进一步加速凋亡进程。因此认为Caspase-3执行着与线虫中的Ced3相同的功能。Caspase-3被称为是“死亡酶”, 而PARP被认为是“死亡底物”。激活的Caspase-3能使许多与细胞结构。细胞周期及DNA修复等相关蛋白或激酶失活,从而导致细胞凋亡。
       肝衰竭实际上是多脏器功能衰竭,故临床表现相当复杂,导致中医据“四诊”收集来的资料千变万化,由此归纳演绎病机病理的概括——证型也就呈现出诸多差异,其治疗也必然随之千变万化,达不到执简驭繁的目的。更有甚者是肝衰竭晚期诸脏俱损,邪毒鸱张,诸症并存,使辨证论治无从入手。“治病求本”“审因施治”“辨病论治及辨证论治相结合”是中医的基本治疗原则及精髓所在。笔者在文献整理的基础上,大胆创新,提出了肝衰竭“毒邪病因”新学说:毒为致病之因,贯穿于疾病的始终,淤、痰为病变之本,“毒”“淤”“痰”胶结为本病基本病机病理，故其治疗原则对应为清热解毒、活血化淤、豁痰醒神，并根据肝衰竭“毒邪病因”新学说总结出来了治疗肝衰竭的有效方药——解毒化淤颗粒,其由茵陈30 g、赤芍50 g、白花蛇舌草30 g、大黄15 g、郁金15 g、石菖蒲15 g等组成,具有清热解毒、活血化淤、豁痰醒神等功效。方以茵陈为君,清利郁于中焦、结于肝胆之湿热毒邪,为退黄的要药;配大黄、白花蛇舌草为臣,其中大黄能畅阳明谷道使湿热之毒从后阴而出,白花蛇舌草清热解毒有助于茵陈以退黄;赤芍既清入血之邪毒,又行留滞之淤,与大黄相配消凝淤败血,与茵 陈相伍去入血之湿毒效宏;石菖蒲、郁金化痰浊、辟秽毒、醒清窍、理升降而畅三焦,合赤芍共为佐药。诸药配伍,使湿热去,浊毒解,痰化淤消,脾运复健而升降有序,肝胆疏泄失职而气畅血行,三焦通利,心智复常,共奏清热解毒、活血化淤 、豁痰醒神之效，本方的功效可谓与肝衰竭的中医病机病理丝丝相扣。其中赤芍、大黄均具有清热解毒、凉血、化淤、退黄之功效,被视为治疗肝衰竭之良药。
       本研究证实解毒化淤颗粒还可从基因和蛋白水平明显降低急性肝衰竭小鼠Caspase-3的表达,提示解毒化淤颗粒对肝组织的Caspase-3表达的抑制,影响了蛋白酶级联切割过程,进而抑制肝细胞凋亡和坏死可能是其预防和治疗急性肝衰竭的机制之一。但解毒化淤颗粒究竟是何种成分在肝细胞凋亡中起到阻断凋亡信号转导,如何阻断,具体作用的靶点在哪,仍有待于进一步探讨。一旦其作用机理明确,将为急性肝衰竭的中西医结合治疗提供有力的理论以及实验依据,为患者带来福音。
       【参考文献】
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