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       【摘要】 
       目的研究复尔康注射液对人肝癌HepG2细胞增殖和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法HepG2细胞增殖采用CCK8试剂盒(cell counting kit-8)进行检测，VEGF的表达采用免疫组化SABC法进行染色分析。结果复尔康注射液可抑制HepG2细胞的增殖，IC50值为(29.63 ± 1.22) mg · L-1;经5，10 mg · L-1的复尔康注射液作用48 h后， HepG2细胞VEGF的表达明显减弱，且呈现出一定的量效关系。结论复尔康注射液可抑制HepG2细胞的增殖和VEGF的表达，抗血管生成可能是复尔康注射液抗肿瘤的作用机制之一。
       【关键词】  复尔康注射液; 肿瘤; 血管内皮生长因子; 血管生成
       Effect of Fuerkang Injection on the Expression of VEGF in HepG2 Cells
       LIU Minghua, LI Rong, LI Mao, XIAO Shunhan*, REN Meiping, FENG Wenyu
       (Laboratory of Pharmacology and Toxicology, Luzhou Medical College , Luzhou 646000, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of Fuerkang injection on the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in hepatoblastomaG2 (HepG2) cells. MethodsThe proliferation of HepG2 was determined by CCK8(cell counting kit-8) assay. The expression of VEGF was tested by SABC immunohistochemical method.ResultsFuerkang injection could inhibited the proliferation of HepG2 cells, and the IC 50 value was (29.63 ± 1.22) mg·L-1. After treatment of Fuerkang injection at concentration of 5，10 mg·L-1 for 48 h, Fuerkang injection strongly inhibited the expression of VEGF in HepG2 cells in a dose-dependent manner. ConclusionFuerkang injection can inhibit the proliferation of HepG2 cells and expression of VEGF, and antiangiogenesis may be one of the mechanisms of its antitumor action.
       Key words： Fuerkang injection; Tumor; VEGF; Angiogenesis
       血管生成(angiogenesis)是指已存的血管(毛细血管和小静脉)通过出芽或分裂的方式产生新的血管[1]。目前抑制肿瘤血管生成已成为抗肿瘤治疗的一个重要方向与研究热点。复尔康注射液是从中药青蒿中提取出有效成分青蒿油，研制成能供静脉给药的多相脂质体注射液。前期的研究结果显示，复尔康注射液能抑制荷H22实体瘤的生长，对荷P388和H22腹水瘤小鼠有明显生命延长作用，对A549和CEM-C7细胞株的生长有抑制作用。为深入探讨复尔康注射液抗肿瘤的分子机制，本实验研究了复尔康注射液对人肝癌HepG2细胞VEGF表达的影响。
       1 材料
       1.1 药品和试剂 复尔康注射液由泸州医学院药物研究所提供，批号：061017;RPMI1640培养基，GIBCO公司产品;CCK8(cell counting kit-8)，碧云天生物技术研究所提供;标准胎牛血清，天津灏洋生物制品科技责任有限公司产品，批号：20070112;SABC试剂盒和DAB显色剂由武汉博士德生物工程有限公司提供，批号：070119。
       1.2 细胞株 人肝癌HepG2细胞，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5% CO2条件下常规培养。
       2 方法
       2.1 CCK8检测对HepG2细胞增殖的影响 取对数生长期的HepG2细胞，0.25%胰酶制成细胞悬液，细胞计数为1×108·L-1，接种于96孔板，每孔90 μl，空白孔加90 μl RPMI1640，37℃，5% CO2培养箱培养24 h后每孔加药10 μl，每个浓度4个复孔，复尔康终浓度分别为2.5，5，10，20，40，80 mg · L-1，阴性对照组加等体积无血清RPMI1640，继续培养48 h，每孔加入CCK8 10μl继续培养1 h，酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度A值，按下列公式计算抑制率，细胞增殖抑制率(%)=[1-(A给药组-A空白孔)/(A阴性对照组-A空白孔)]×100﹪，LOGIT法计算半数抑制浓度(IC50)。
       2.2 免疫组化SABC法检测VEGF的表达 调整HepG2细胞悬液密度为5×107·L-1。接种于预先铺好盖玻片的24孔板，每孔450 μl，37℃，5% CO2培养箱培养24 h。每孔加药50 μl，使其终浓度分别为5，10 mg·L-1(分别设为复尔康注射液低、高剂量组)，同时设复尔康注射液终浓度为10 mg·L-1时相应的溶剂为溶媒对照，阴性对照组加等体积无血清RPMI1640，37℃，5% CO2培养箱继续培养48 h。吸净培养液，PBS液洗2次，勿使细胞脱落。按免疫组化SABC染色试剂盒说明书步骤染色、封片、显微镜观察。胞浆和胞膜出现棕黄色颗粒为VEGF阳性染色，每组随机采取8个视野拍照，结果用Image-Pro plus6.0图像分析软件进行分析，检测其阳性物质的积分光密度平均值(IOD mean)。结果用±s表示，用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析(组间比较用SNK法)。
       3 结果
       3.1 CCK8检测对HepG2细胞增殖的影响 当复尔康注射液终浓度大于5 mg·L-1时， HepG2细胞的增殖即受到抑制，且呈明显的剂量依赖性，其IC50值为(29.63 ± 1.22)mg·L-1。见图1。
       图1 复尔康注射液对HepG2细胞增殖的浓度抑制率曲线(n=3)
       3.2 免疫组化SABC法检测VEGF的表达 阴性对照组与溶媒对照组HepG2细胞均明显表达VEGF，VEGF分布于胞质及胞膜，呈棕黄色颗粒状，细胞阳性率为99%，复尔康注射液作用48 h后HepG2细胞VEGF的表达不同程度减弱，见图2。采用Image-Pro plus6.0图像分析软件进行分析，复尔康注射液组的阳性物质积分光密度平均值明显降低，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P﹤0.01)。结果见表1。表1 HepG2细胞VEGF表达免疫组化染色积分光密度平均值
       4 讨论
       肿瘤发生、发展、浸润及转移的各个阶段，均有赖于肿瘤的血管生成，新生血管提供肿瘤生长所需的营养，排除代谢产物，同时也是癌细胞播散的途径，又能促进血管渗漏。血管生成构成了肿瘤进程中的重要调节点[2]。肿瘤细胞(含间质细胞)分泌多种血管生成因子参与调节血管生成，其中以VEGF的作用最为突出[3]。VEGF与其受体结合后，可释放各种生长因子及细胞因子，并以多种方式促进肿瘤血管生成，从而为肿瘤的浸润、转移创造条件[4]。Yamaguchi等[5]认为在肝细胞癌的发展过程中，血管内皮生长因子作为一种特异的作用于血管内皮细胞的多功能蛋白，可诱导微血管形成，增加血管通透性，促进肿瘤的浸润及转移，认为VEGF的表达与肝细胞癌的复发及预后密切相关。肿瘤的生长依赖于脉管系统的新生，限制血管新生能控制肿瘤生长，最有效的途径包括阻断VEGF信号通路，阻断VEGF通路从而抑制肿瘤生长已在临床前模型上得到证实[6]。VEGF为促进肿瘤新生血管形成及转移的主要因子之一[7]，与肿瘤的发生、发展息息相关。因此，可通过抑制肿瘤细胞中VEGF的分泌来抑制肿瘤的生长及转移是治疗肿瘤的一条新途径。
       青蒿是药源广泛、价廉易得的中药，近年来研究表明，青蒿素及其衍生物具有明显的抗肿瘤作用，作用机制可能与肿瘤细胞内自由基的产生及氧化应激、延迟细胞周期、诱导细胞凋亡和抗血管生成等有关[8]。复尔康注射液是从中药青蒿中提取出有效成分青蒿油，研制成能供静脉给药的多相脂质体注射液。本实验结果显示复尔康注射液对体外培养的HepG2细胞的增殖具有抑制作用，且呈现出良好的量效关系，其IC50值为(29.63 ± 1.22 )mg·L-1。经不同浓度的复尔康注射液作用48 h后，HepG2细胞VEGF的分泌表达不同程度减弱，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P﹤0.01)，具有一定的抗血管生成作用。结合我们前期对复尔康注射液抗肿瘤活性的实验研究，揭示抗血管生成为其抗肿瘤的作用机制之一。
       【参考文献】
         　　[1] Risau W. Mechanisms of angiogenesis[J]. Nature,1997，386：671.
       
       [2] Visconti RP,Richardson CD,Sato TN.Orchestration of angiogenesis and arteriovenous contribution by angiopoietins and vascular endothelial growth factor(VEGF)[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2002，99(12):8219.
       
       [3] Hicklin DJ,Ellis LM.Role of the vascular endothelial groeth factor pathway in tumor growth and angiogenesis[J].J Clin Oncol, 2005，23(5):1011.
       
       [4] Tanaka S,Arii S.Current status and perspective of antiangiogenic therapy for cancer: hepatocellular carcinoma[J].Int J Clin Oncol, 2006，11(2):82.
       
       [5] Yamaguchi R,Yano H,Iemura A,et al.Expression of vascular endothelial growth factor in human hepatocellular carcinoma [J].Hepatology, 1998，28(1):68.
       
       [6] Dorrell MI,Aquilar E,Scheppke L,et al.Combination angiostatic therapy completely inhibits ocular and tumor angiogenesis[J].Proc Natl Acad sic U S A, 2007，140(3):967.
       
       [7] 张 峰.人参皂甙对肝癌介入前后VEGF、AFP的影响[J].山东医药，2007，47(13)：39.
       
       [8] 肖凤春，林 隆，沈培强.青蒿素及其衍生物抗肿瘤研究进展[J].国外医学·中医中药分册，2005，27(3)：149.