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       【摘要】 
       目的建立龙胆最佳提取工艺，为龙胆的种植和质量研究奠定基础。方法采用L9(34)正交表安排实验,确定最佳提取条件。色谱柱为Shimadzu C18(3.0 mm×75 mm, 1.7 μm);流动相为乙腈-0.4%磷酸(V∶V= 5.5∶94.5)，流速0.80ml/min;检测波长235，270 nm;柱温为40℃。结果影响因素最大的是提取溶剂，其次是提取方法，最小的是提取时间。结论各因素较优的水平组合为A1B1C1，即甲醇超声提取30 min。
       【关键词】  龙胆; 正交实验设计法; 獐牙菜苦苷; 龙胆苦苷
       Orthogonal Experimental Design for Optimization of Extraction of Medicinal Gentian
       CAO Yue1,2, ZUO Daiying2, WANG Weining1,LIU Jingwu3,SUN Qishi2*
       (1.Liaoning Provincial Institute of Food and Drug Control, Shenyang 110023, China;2. Shenyang Pharmacological University, Shenyang 110016,China;3. Liaoning Tianrui Science and Technology Development Co., Ltd. Qingyuan 113300, China)
       Abstract：ObjectiveTo establish best extraction process of Gentiana scabra Bge.by UPLC so as to provide base for the plant and research of Gentiana scabra Bge. MethodsBy L9(34)orthogonal design , the optimal condition was confirmed as follows: Shimadzu C18(3.0 mm×75 mm,1.7μm), Acetonitrile-0.1% Phosphorylation(V∶V = 5.5∶94.5) as nwbile phase the flow rate was 0.8 ml/min, detection wavelength was 235nm and 270nm and the columne temperature was 40℃. ResultsThe extraction solution was the most effective factor ,the second was the method，and the last was the extraction time. ConclusionThe best extraction process is A1B1C1 : super sonic extraction for 30 min in methanol.
       Key words： Gentiana scabra Bge. ; Orthogonal design; Swertiamarin ; Gentiopicroside
       龙胆为龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag.，龙胆Gentiana scabra Bge.，三花龙胆Gentiana triflora Pall.或坚龙胆Gentiana rigescens Franch.的干燥根及根茎[1]。具有清热燥湿、泻肝胆火的作用。我国主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等地。现代药理研究证明,龙胆苦苷具有显著的肝脏保护、抗炎、抗病原微生物、中枢兴奋及健胃利胆等作用,与中医对龙胆的应用基本上一致[2]。龙胆的主要有效成分为环烯醚萜类化合物，有龙胆苦苷(Gentiopicroside)、獐牙菜苦苷(Swertiamarin)及獐牙菜苷(Sweroside)等,这类物质也是其苦味的物质基础[3]，但这类成分极性较大，稳定性较差，所以对提取的条件要求较高。本实验探讨了溶剂类别、浓度、提取方法、提取时间对龙胆有效成分提取的影响，为龙胆化学成分研究及有效成分的合理利用奠定基础。
       1 仪器与试剂
       岛津-UPLC超高效液相色谱仪，LC-solution色谱工作站。獐芽菜苦苷对照品(北京中西远大科技有限公司，批号070316 纯度99.06%)，龙胆苦苷对照品(中国生物制品检定所，批号110770-200510)，磷酸为分析纯，其余试剂均为色谱纯。
       2 方法与结果
       2.1 对照品溶液的制备分别精密称取獐牙菜苦苷和龙胆苦苷对照品适量,加甲醇制成0.15mg/ml和0.3mg/ml的溶液。
       2.2 色谱条件色谱柱为Shimadzu C18 (3.0mm×75 mm, 1.7μm);流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液(5.5∶94.5)，流速0.8ml/min，检测波长分别为235 nm和270 nm，柱温40℃，进样量4 μl。
       2.3 实验因素与水平根据预实验结果,以提取溶剂、提取方法、提取时间3个因素，每个因数3个水平，采用L9(34)正交表安排实验。见表1。表1 实验因素与水平
       2.4 正交实验称取龙胆药材27份(药材来源于辽宁省龙胆药材GAP生产基地) ,按表2安排实验。以龙胆苦苷、獐牙菜苦苷的含量加和为指标,采用直观分析法、方差分析,确定最佳工艺条件。综合评分结果=獐牙菜苦苷含量+龙胆苦苷含量。表2 正交实验方案及结果
       2.5 极差分析与方差分析对表2数据分析，结果见表3～4。　表3 直观分析结果表4 方差分析
       由方差分析的结果，可以看出条件，A>B>C，结合直观分析，确定最佳提取工艺为：A1>B1>C1，即甲醇超声提取30 min。
       2.6 獐牙菜苦苷和龙胆苦苷的测定 按照上述的条件，取龙胆药材，测定。两个指标性成分，精密度实验：RSD分别为1.92%,0.32%(n=5);稳定性实验：16 h内稳定性良好，峰面积RSD分别为1.65%,0.31%;重复性实验：RSD分别为0.79%,2.0%(n=6);回收率实验：獐牙菜苦苷的平均回收率102.09%，RSD为1.68%(n=6);龙胆苦苷的平均回收率103.80%，RSD为1.11%(n=6)。
       3 讨论
       本实验采用的药材来源于辽宁省龙胆药材GAP生产基地，所考察的指标将对品种的种植和采收期的确定有很大的指导意义。影响龙胆提取率的因素也很多，如溶剂类别、浓度、提取方法、提取时间、药材粉碎度、温度、提取次数等因素，但结合药材采收后的特点，我们选择了提取溶剂、提取方法、提取时间这3个较为关键的因素作为考察条件，每个因素3个水平，采用L9(34)正交表安排实验，制备样品溶液进行测定。
       UPLC超高效液相色谱仪是目前较为先进的色谱技术，它有出峰快、分离度高的特点，本品所测定的成分极性较大，出峰较晚，使用UPLC技术可以明显改善出峰时间。
       通过分析正交实验设计法的结果，我们发现在使用甲醇作为溶剂、提取时间为30 min时，超声提取和回流提取两种方法所测定的两个指标性成分的含量基本一致，但考虑到回流的操作相对复杂，而且一旦超出规定的回流时间，两类成分含量损失较大，分析原因是两类成分均为裂环烯醚萜苷类化合物，受热易分解，因此选择了耐用性较好的超声提取方法，并且在操作中严格控制温度。
       按照上述的最优条件提取样品，经过方法学数据验证(见“2.6”项)，该方法科学、合理，可以将龙胆的有效成分提取完全。
       【参考文献】
         　　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005.
       
       [2] 刘 涛，才 谦，付玉芹,等.中药龙胆的研究进展[J].辽宁中医杂志,2004,1:85.
       
       [3] 郑虎占，董泽宏，佘 靖.中药现代研究与应用，第2卷[M].北京:学苑出版社，1997：1398.