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       【摘要】 
       目的制作中度液压脑损伤动物模型，并对模型进行评估。方法雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、创伤3 d组，创伤7 d组。创伤组冲击力大小为：(170±10)kPa, 作用时间为(20±2)ms。结果损伤组75%动物在创伤后立即出现大鼠反射消失、昏迷、四肢运动功能减弱，甚至去脑强直，且可出现呼吸暂停，并具有15%左右的死亡率。应用NSS评价表明，创伤3 d组创伤后1，3 d评分分别为(14.77±1.17)和(13.38±0.65)，创伤7 d组创伤后1，3 ，7 d评分分别为：(14.62±0.65)，(13.15±0.69)，(14.31±0.75)，与同期正常组比较，P<0.01。光镜和电镜观察均表明正常组与创伤组之间差异明显。结论液压脑损伤装置可以建立中度创伤性脑损伤动物模型，且冲击力定量准确，制作的模型稳定性和重复性良好，NSS在评估液压性创伤性脑损伤模型上具有准确、简便的特点，值得进一步推广应用。
       【关键词】  创伤性脑损伤; 液压脑损伤; 动物模型; NSS
       创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury ,TBI)是世界性的多发性疾病，也是死亡率和致残率最高的疾病之一。其中中度TBI占有相当大的比例。建立合适的颅脑损伤模型以研究TBI的机理对于临床相当重要。本文就应用液压脑损伤装置制作中度脑损伤模型的方法进行研究并对模型进行评估。
       1 材料与方法
       1.1 动物来源及分组SPF级、雄性SD大鼠64只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2002-0003。体重(320±10) g，实验大鼠于动物室内分开笼中喂养，室内温度为(17±3)℃，湿度为(50±20)%，每日光照12 h，并提供约50 g全营养鼠粮及足量清洁饮水。应用SPSS软件将大鼠随机分为4组：正常组和假手术组各14只，模型3 d组、模型7 d组各18只。
       正常组和假手术组于损伤后7 d处死，模型组分3 d、7 d两个时间点处死动物。
       1.2 颅脑创伤模型的制作本研究所用液压脑损伤装置由天津市环湖医院从美国弗吉尼亚州立大学定制并提供使用。
       1.2.1 手术步骤随机挑选动物，大体观察无异常表现后，称取体质量并记录。腹腔注射10%水合氯醛0.2 ml/kg体重进行全身麻醉，保持自主呼吸。俯卧位固定于动物立体定位头架，保持顶骨左右位水平、前后位切线水平。顶部备皮、消毒，做正中矢状切口，长约1.5 cm，双极电凝止血，钝性剥离暴露颅骨，于左顶部矢状缝旁开2 mm，冠状缝后2.5 mm，用台式牙钻行颅骨钻孔，磨开一直径4 mm的圆形骨窗，并注意保持硬脑膜完整，用骨蜡或无菌棉签止血、冲洗洁净备用。用水门汀将直径5 mm的打击管与骨窗相互粘牢，粘合部位固化20 min，达到水密且牢固的效果。
       1.2.2 打击过程与复苏先将粘于颅骨上的打击管内注满37℃生理盐水后，将动物连接于液压冲击装置，使打击管与鼠头矢状面平行，与冠状面平行呈垂直打击。开启并调整数字示波记录器、信号放大器进入待命状态后，调整摆锤、摆杆抓钩至所需位置完成打击前准备，等动物掐尾反射出现后进行打击。冲击能量通过液压连通器原理导入封闭的颅腔内，造成脑创伤。装置通过光电自动控制完成对冲击时程和强度的检测与记录，显示于示波器并作记录留分析。撤除粘合于动物颅骨的打击管，经过必要的复苏后再以骨蜡封闭打击骨窗，缝合切口。
       冲击时程和强度于示波器分别以毫秒(ms)和毫伏特(mV)显示，作用于大鼠脑部的作用力在示波器显示为单峰，将代表强度的电压(mV)显示换算为压强(atm)的公式为：Y= X×0.006 8，其中X代表实测显示的mV大小，Y为所转换后求得的压强，0.006 8为固定系数。并将压强换算为kPa。经多次前期预实验证明：调整打击锤角度至12度，则产生的压力大小(170±10)kPa，作用时间为(20±2)ms，即为本实验所需要的实验条件。
       假手术组动物麻醉后仅行颅骨钻孔及固定打击头，不进行液压冲击致伤，骨蜡封闭钻孔后缝合切口。正常组不进行任何损伤。
       1.3 神经行为学评价应用NSS(neurological severity score)量表[1，2]对大鼠进行神经行为评价。正常大鼠神经行为评价总分为19分。正常组和假手术组均于创伤后1d、3d、7d评分。模型3 d组于创伤后1d、3d评分;模型7 d组于创伤后1d、3d、7d评分。
       1.4 病理形态学观察
       1.4.1 光镜观察4组动物每组各用4只动物分别作光镜观察。各组动物按时间要求再次麻醉后，迅速取损伤区脑组织浸入4%多聚甲醛内4℃固定48 h后，修成厚4 mm块，常规酒精脱水，石蜡包埋，行5 μm冠状切片，作HE染色，Olympus显微镜下观察、照像。
       1.4.2 电镜观察4组动物每组各用3只动物分别作电镜观察。各组动物按时间要求再次麻醉后，迅速取损伤侧海马，投入2.5%戊二醛缓冲液中固定5～10 min，等组织稍变硬后，在显微镜下修整为1 mm×1 mm×1 mm小块，2%戊二醛/0.1 MPB(pH7.4)内，室温固定2 h，0.1 mol/lPBS清洗3次，10 min/次，1%锇酸固定30～120 min，再用0.1 mol/L的PBS清洗20 min，按50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、100%丙酮(2次)，各5 min进行梯度脱水，丙酮与环氧树脂1∶1混合浸透2h，再以纯环氧树脂包埋剂浸透2 h，包埋，80℃恒温箱内聚合10 h，修块，半薄切片，光镜定位后，进行超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色各10 min，透射电镜观察、拍照、记录和分析。
       2 模型评估
       2.1 伤后体征观察中度液压脑损伤后可致75%的大鼠反射消失、昏迷、四肢运动功能减弱，甚至去脑强直等神经功能障碍5 min左右，且可出现持续约10 s呼吸暂停。且有15%左右的死亡率。
       假手术组有1只大鼠于开骨窗时损伤硬脑膜致出血故予以弃除;创伤3 d组2只大鼠死亡：创伤后15 min因打击后呼吸停止，抢救无效死亡1只;第3天因高颅压，脑疝死亡1只。创伤7 d组3只大鼠死亡：创伤后1 h因打击后大量鼻出血，死亡1只;第3天因高颅压，脑疝死亡1只;第5天因颅内出血死亡1只。
       2.2 NSS评分见表1。表1 TBI对大鼠NSS评分的影响与正常组比较，aP>0.05，bP<0.01;与创伤7 d组比较：cP>0.05
       2.3 病理形态学
       2.3.1 光镜 ①正常组：肉眼下脑组织表面光滑，沟回整齐、清晰，无充血，肿胀及出血灶。HE染色后观察：脑组织结构正常，细胞排列有序，染色均匀，无出血、肿胀及损伤，未见炎性细胞浸润、血管扩张现象。皮层神经元细胞呈圆形或者椭圆形，核膜完整，核仁清晰可见，核仁淡染呈蓝色，周围神经纤维致密，着色均匀;②假手术组与正常组比较，无明显差别，部分切片偶可见到少许神经元肿胀，体积增大，核膜欠清;③创伤3 d组：肉眼观察，骨窗对应处的脑皮质凹陷，脑皮质表面挫裂伤，其他部位脑组织弥漫肿胀。镜下观察：蛛网膜下腔出血可延及双侧大脑半球，以伤侧为明显，偶尔可扩展到小脑表面。脑实质内有明显出血，累及额顶叶感觉运动区，并延及伤侧海马、外囊、纹状体和胼胝体，且出血灶周围血管扩张，微血管外间隙明显增大，神经胶质细胞和组织间隙水肿明显，炎性细胞浸润，部分红细胞被吞噬细胞吞噬、两侧半球有散在的损伤神经元，核呈固缩状。胞质与胞核黏附在一起，胞质强烈嗜伊红，呈严重缺血性改变。同时可见大量的中性粒细胞和单核巨噬细胞积聚在水肿带，部分浸润脑实质;④创伤7 d组：肉眼观察，骨窗对应处的脑皮质凹陷，脑皮质表面挫裂伤减轻，其他部位脑组织肿胀。镜下观察：蛛网膜下腔出血及脑实质内出血部分吸收，组织水肿减轻，伤区炎症细胞略减少，胶质细胞和纤维组织增生，可见泡沫细胞。
       2.3.2 电镜①正常组：可见正常的内质网、线粒体、高尔基体和多聚核糖体等结构，胞体胞核形态、大小正常。可见正常形态毛细血管管腔，电镜下呈圆形或椭圆形，其内有较多红细胞，与管壁间有血浆形成的间隙，血管周围无环形水肿，可见正常海马神经元;②假手术组：可见到正常的多聚核糖体和粗面内织网和近似于正常的血管，血管周围线粒体轻度肿胀，但血管周围无环形水肿;③创伤3 d组：可见到海马神经元固缩，胞浆内大量线粒体肿胀、水肿，胞核皱缩，甚至固缩，核膜凹陷，嵴断裂，多聚核糖体解聚，神经细胞胞体及突起固缩，电子密度增高，细胞及血管外周星形细胞突起肿胀，严重的星形细胞胞浆肿胀，和因缺血缺氧导致的细胞内皮细胞核反应性增大;④创伤7 d组：与创伤3 d组比较，细胞损伤得到减轻，神经元接近正常，但仍可看到血管周围星形细胞突起肿胀、水肿，线粒体肿胀，嵴消失，因缺血缺氧导致的内皮细胞胞核反应性增大，和因组织坏死，损伤导致细胞器退变而形成的髓样小体，凋亡早期的海马神经元。
       3 讨论
       TBI实验模型在研究和理解与TBI相关的复杂的生理、神经行为和组织病理方面的变化中扮演着重要的角色。液压损伤法原理是通过液压装置骤然改变密闭颅腔内的压力而间接造成脑损伤。是近十余年来应用最广的颅脑创伤模型，它的致伤机理类似与人类头部撞击后发生的脑变形。NSS作为一种从整体上评价动物损伤程度的量表，较之单一的行为学评价方法具有明显的优势，本研究也证实NSS在液压创伤性脑损伤动物模型的评价方面有良好的可靠性。
       实验中为使结果更加真实、稳定，需注意以下几个方面：①最为重要的是防止液压打击系统压力泄漏;②摆锤的长度因为设计加工时为可调节性的，一旦条件确定后，其与摆杆之间的固定螺丝必须旋紧固定;③液压活塞缸体及其所有连接部件内必须充满经超声脱气的去离子水，保证没有气泡，这样可以尽量减少冲击时的时程及压强波动;④每次打击前必须将液压缸体活塞端调整至其外端的被打击缓冲垫与处于自由悬吊状态下的摆锤打击接触面间处于临界接触状态，而且两侧接触面的角度须调整到正向完整对合，保证由势能转化的动能冲量被瞬时全部传递给液压缸体;⑤打击前为最大程度控制麻醉对于实验结果的干扰，动物必须处于半清醒状态，具体指征包括：钳夹肢体、尾或耳出现挣扎，角膜反射恢复，吸痰时明显呛咳，未受刺激时安静不动;⑥用牙钻开骨窗，注意保持硬脑膜完整，如果损伤硬脑膜，则需将该动物从模型组剔除;⑦用水门汀打击管与骨窗相互粘牢时，要调好水门汀的浓度和用量，不可过稀和用量太多而堵塞打击管，影响压力的传递;⑧绝对避免打击锤二次打击液压活塞，造成大鼠二次脑损伤，而加重大鼠脑损伤的程度。
       本研究使用标准化的手术方法及利用立体定向控制仪、国际通用的液压打击仪，并优化实验流程，建立一个精度高、稳定性强、重复性好、操作简便的大鼠液压颅脑损伤模型。为进一步深入开展TBI的相关动物实验研究奠定坚实基础。
       致谢：南开大学医学院车永哲教授在光镜观察中给予的指导;天坛医院电镜室孙异临教授在电镜观察中给予的帮助。
       【参考文献】
         　　[1] ShapiraY,LamAM,ClavinCE,et al.Therapeutic time windows and dose response of the beneficial effects of ketamine in experimental head injury[J].Stroke, 1994, 25: 1637.
       
       [2] Mcintosh T K, Vink R, Noble L,et al. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model[J].Neurosci,1989,28:233.