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       【摘要】 
       目的研究环维黄杨星D(CVB-D)透皮贴剂对实验性新西兰兔心肌缺血模型的影响。方法通过结扎冠状动脉左旋支制备心肌缺血动物模型，将15只新西兰兔随机分为3组，以模型组为对照，分别考察CVB-D贴剂组和CVB-D口服给药组，对试验动物心电图、血浆乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性、丙二醛(MDA)含量的影响，并对缺血部位心肌壁内膜进行病理学检查。结果模型组动物心电图T波抬高，ST段偏移明显，血浆LDH、CK活性和MDA含量明显升高(P<0.01)，坏死心肌细胞表现为核固缩与核溶解，细胞浆崩解为细颗粒状。贴剂给药组和口服给药组均能显著抑制血浆LDH、CK活性和MDA含量升高(P<0.05)，贴剂给药组在32 h内药效作用较为平稳，但与口服组比较并无统计学差异(P>0.05)。结论CVB-D透皮贴剂对新西兰兔心肌缺血性损伤具有保护作用。
       【关键词】  环维黄杨星D; 透皮贴剂; 心肌缺血; 药效学
       Abstract：ObjectiveTo explore the pharmacological actions of Cyclovirobuxine D(CVB-D) transdermal patch in rabbit models with myocardial ischemia.MethodsThe animal model with myocardial ischemia was prepared by ligating the left branch of cornary artery of L-branch.15 New Zealand albino rabbits were randomly divided into 3 groups: CVB-D patch group, oral CVB-D group and model group. Electrocardiogram，activities of plasma lactic dehydrogenase(LDH)，creatine kinase (CK) and the malondialdehyde content (MDA) in experimental animals were investigated. The endomyocardial injury to myocardial ischemia was performed by pathological examination.ResultsThe results of the model group were summarized as follow: ECG T-wave elevation，significant ST segment deviation，the significant plasma LDH，CK activities and the MDA content(P<0.01)，karyopyknosis and karyolysis in myocardial necrosis cells，finely granular disintegration of cytoplasm. Patch group and oral group could inhibit the inerease of plasma LDH，CK activities and MDA content(P<0.05). The pharmacodynamic effects of patch group were relatively stable within 20 hours，but there had no statistical significant difference between patch group and oral group(P>0.05).ConclusionCVB-D patch has protective effect against myocardial ischemia in New Zealand albino rabbit model.
       Key words：Cyclovirobuxine D;Transdermal patches; Myocardial ischemic;Pharmacodynatics
       黄杨宁系从黄杨科植物中国小叶黄杨Buxus microphylla Sieb.et Zucc.var.sinica Rehd.et Wils.及其同属植物中提取得到的生物碱，其主要有效成分环维黄杨星D(Cyclovirobuxine D，CVB-D)是《中国药典》2000年版Ⅰ部的新增品种。多年临床应用显示，黄杨宁对冠心病、心绞痛、心功能不全等疾病具有良好疗效。本研究将CVB-D研制成经皮给药制剂，并应用于冠状动脉(冠脉)结扎诱导的心肌缺血性兔模型，采用多个药理学指标对其药效进行了考察，以期用新的给药途径达到持续性预防、治疗目的，同时亦为其它中药经皮给药系统的研究开发提供借鉴，促进中药新型给药系统的发展。
       1 材料与仪器
       1.1 药品与试剂CVB-D原料药(纯度98%)，南京朗泽医药科技有限公司出品;黄杨宁片(批号：20090303)，南京小营药业集团有限公司。乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号：20090505，20090730，20090811)，肌酸激酶(CK)试剂盒(批号：20090505，20090730，20090811)，丙二醛(MDA)试剂盒(批号：20090505，20090730，20090811)，以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。Eudragit 100(E 100)，德国Rhm公司。
       1.2 仪器AD Instrument powerlab 8/30生理机能仪，配套Chart5 for windows data acquisition system，澳大利亚AD INSTRUMENTS公司;752型紫外光栅分光光度仪，上海分析仪器厂;TDL-5000B型低速冷冻多管离心机，上海安亭科学仪器厂;BP211D电子分析天平，德国 Sartorius 公司;东方-A型直热式电热恒温干燥箱，广州东方电热干燥设备厂出品。
       1.3 动物健康成年新西兰兔，15只，雄性，体质量(2.0±0.2)kg，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)2009-0001。
       2 方法
       2.1 CVB-D透皮贴剂的制备称取丙烯酸树脂E100 1.5 g，交联剂0.675 g，加入无水乙醇2 ml静置过夜，使充分溶解、交联，加入增塑剂0.675 g，透皮促渗剂0.111 g混匀。称取CVB-D原料药200 mg，以无水乙醇2 ml溶解，与上述压敏胶液混合搅拌均匀后，静置一段时间使气泡排出，涂布于防黏纸上，置于烘箱以80℃固化10 min后转移至背衬层，切割，制备成载药量为1 mg/cm2的贴剂。
       2.2 心肌缺血动物模型的制备心肌缺血动物模型的制备主要有药物注射法(如垂体后叶素、异丙肾上腺素、麦角新碱等腹腔、皮下或静脉注射)，冠脉结扎法及电刺激法等。本研究根据经皮给药制剂药效学研究需要，选用冠脉结扎法制备新西兰兔心肌缺血模型。
       2.2.1 手术操作将新西兰兔随机分成3组，模型组3只动物，治疗组每组6只动物，依次为CVB-D贴剂组、CVB-D口服给药组。贴剂组胸腹部以8%硫化钡溶液脱毛后，饲养6 d。实验动物耳缘静脉注射20%乌拉坦溶液(3 ml·kg-1)麻醉，仰位固定，标准II导联记录正常心电图。分离右股动脉，实施股动脉插管，采集空白血浆。沿胸骨中线切开皮肤，暴露胸骨，沿胸骨左缝剪断1根肋骨，用小开胸器轻轻撑开胸腔切口，可见心包及搏动心脏。提起心包膜正中，用眼科剪将心包膜前部剪开，用止血钳将左心耳轻轻提起，用持针器持小弯针在左冠状动脉左旋支根部穿一线，结扎之。把心脏放回胸腔，迅速缝合胸壁。贴剂组立即于脱毛皮肤给予贴剂(给药面积100 cm2，载药量1 mg/cm2)，口服组立即以黄杨宁片混悬液(5 mg·kg-1)灌胃给药，给药后观察记录15 s，30 s，1 min，5 min，15 min，30 min，1 h，2 h的心电图，并于0.5，1，2，3，4，6，8，10，12，16，20，24，28，32 h从股动脉采血1.5 ml置于肝素化试管中，离心(5 000 r·min-1，15 min)，定量吸取血浆0.5 ml，4℃保存，测定血浆中LDH和CK活性，MDA含量。
       2.2.2 生化指标的测定LDH活性测定是利用LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。CK活性采用肌酸量法测定，根据生成无机磷的量可测出酶的活力。MDA含量测定是利用其可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰的特点进行。以上各项指标均使用相应试剂盒测定。
       2.2.3 实验数据的处理所有实验数据用SPSS17.0软件进行统计学分析，各项指标比较采用组间t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
       3 结果
       3.1 环维黄杨星D对心肌缺血家兔心电图的影响结扎动物冠脉后，15 s内模型组与治疗组均出现T波抬高，ST段向上偏移的现象，见图1～2。60 min后，模型组动物心电图表现为T波低平、倒置，Q-T间期明显延长。(见图3)。而CVB-D贴剂组心电图T波低平、倒置，心率减慢现象较为缓解。结果见图4。图1 冠脉结扎前新西兰兔心电图
       3.2 对新西兰兔血浆LDH和CK活性的影响LDH和CK是存在于心肌细胞浆中的酶，只有在心肌细胞受到损伤或坏死时，它们才可能大量释放到血液中，因此测定血中两者活性可以反映心肌坏死程度。
       实施冠脉结扎手术后，模型组兔血浆LDH和CK活性均明显升高，24 h数据与0 h数据相比，P值均小于0.01。各治疗组与模型组比较，均可显著降低血浆LDH和CK活性(P<0.05)。而贴剂组与口服组相比，药效作用达峰较慢，但10 h后口服组LDH和CK活性升高较快，而贴剂组药效较为平稳，两种剂型对血浆LDH和CK活性影响并无显著性差异(P>0.05)。血浆LDH活性经时变化过程见图5，CK活性经时变化过程见图6。图2 冠脉结扎后15 s模型组新西兰兔心电图图3 冠脉结扎后120 min模型组新西兰兔心电图图4 冠脉结扎后120 min贴剂给药组新西兰兔心电图图5 模型组和治疗组血浆LDH活性经时变化曲线图6 模型组和治疗组血浆CK活性经时变化曲线
       3.3 对新西兰兔血浆MDA含量的影响MDA为众多脂质过氧化产物的一种，测定MDA的含量可以反映脂质过氧化程度，间接反映出细胞损伤程度。实施冠脉结扎手术后，模型组兔血浆MDA含量迅速升高，20 h数据与0h数据相比，P值小于0.01。但20 h后模型组血浆MDA含量开始下降，可能是侧支循环逐渐形成，一定程度上缓解了心肌缺血。各治疗组与模型组比较，均可显著降低血浆MDA含量(P<0.05)。贴剂组与口服组相比，药效作用达峰较慢，但贴剂组药效较为平稳，两种剂型降低MDA含量的药理作用并无显著性差异(P>0.05)。血浆MDA含量经时变化过程见图7。图7 模型组和治疗组血浆MDA含量经时变化曲线
       综上所述，新西兰兔在冠脉结扎后，LDH、CK和MDA含量均有明显升高，手术后20 h的数据与0 h的数据比较，各组P均小于0.01。随着时间推移，治疗组药物开始进入体内，到达靶部位，LDH、CK和MDA含量都开始降低，说明药物开始起效。贴剂组与口服组相比达峰较慢，药效约在10 h达到峰值。达峰后口服组LDH、CK和MDA含量上升较快，而贴剂组药效较为平稳。
       3.4 结扎部位心肌壁内膜面病理学观察结果心肌酶学指标考察结束后摘取动物心脏，用冰NS洗尽残血，用滤纸吸干，称重，取心尖组织于10%的中性福尔马林中4℃固定24 h。取心肌组织块，经甲醛固定后，常规石蜡包埋，切片。二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。进行苏木素伊红染色，常规脱水，透明，封片观察，结果见图8。
       心脏标本经肉眼观察，表面均可见结扎线头，线头以下部位可见大小不等的暗红色出血状板块，表面平滑。其中模型组斑块较大，直径约6～8 mm，贴剂组斑块较小，直径约2～3 mm。镜下检测，模型组结扎部位心肌壁的内膜可见心肌细胞呈片状或索状坏死，表现为核固缩及核溶解，细胞浆崩解为细颗粒状，坏死灶周围可见散在炎症细胞浸润。CVB-D贴剂组结扎部位心肌壁的内膜坏死灶较小，呈片状或条索状，与正常心肌组织交错，未见纤维组织增生。实验结果表明，CVB-D透皮贴剂具有一定的抗心肌缺血的作用。
       4 讨论
       心血管疾病是当今威胁人类生命健康的重大疾病，而冠心病又是心血管疾病的焦点。心肌缺血模型建立方法有很多种，包括冠状动脉阻塞动物模型、收缩环法、纤维素膨胀环法、Delran缩窄器法、压迫法、高脂饮食法、药物注射法、冠脉结扎法等[1]。本研究所采用的冠脉结扎法诱发新西兰兔心肌缺血，是研究抗心肌缺血药物疗效的经典模型之一，具有成功率高、重复性好的特点，能直接客观反映药物对心脏的作用。
       文献报道[2～4]，CVB-D口服给药与经皮给药血药浓度峰值分别在给药后3 h与4 h出现，其药理效应明显滞后于血药浓度，故不能将血浓与效应直接联系，而应采用PK-PD结合模型，通过效应室将两者联系起来，相关研究有待深入进行。　图8 结扎部位心肌壁内膜面病理切片图
       研究[5，6]表明CVB-D可显著改善垂体后叶素、异病肾上腺素及冠脉结扎所致大鼠心肌缺血的病理改变，其作用机理可能与提高SOD活性，降低MDA和LDH含量，升高NOS水平及抑制心肌缺血模型大鼠心肌细胞凋亡等因素有关，因此对试验动物体内NO浓度变化进行监测，并将结果与其他药效指标进行对比分析有利于该药作用机制的探讨。
       【参考文献】
         　[1] 吴 涛. 心肌缺血动物模型制备方法[J].中国康复医学杂志，2006，21(2)：180.
       
       [2] 文红梅，池玉梅，李 伟. HPLC-MS法测定犬血浆中环维黄杨星D的浓度及其药代动力学研究[J]. 中国天然药物，2004，2(3)：162.
       
       [3] 余 鹏，刘文英，高 曙，等. 环维黄杨星D在健康受试者体内的药动学研究[J]. 中国药学杂志，2008，43(3)：203.
       
       [4] 李秀梅，周莉玲，于 洋. 环维黄杨星D透皮贴剂的药动学研究[J]. 中药新药与临床药理，2009，20(3)：231.
       
       [5] Vacca G，Battaglia A，Brunelleschi S，et al. Hemodynamic effeets of the intravenous administration of cyclovirobuxine D in anesthetized pigs[J]. Life Sci，1997，61(17)：248.
       
       [6] Grossini E，Battaglia A，Brunelleschi S，et al. Coronary effects of cyclovirobuxine D in anesthetized Pigs and in isolated Porcine coronary arteries[J]. Life Sci，1999，65(5)：51.