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       【摘要】 
       目的探讨异甘草素体外抗氧化作用及其对Hela细胞氧化还原状态的影响，考察异甘草素抑制宫颈癌Hela细胞增殖与活性氧的关系。方法采用化学方法测定异甘草素对羟自由基，DPPH，超氧阴离子清除率和抑制脂质过氧化的抑制率，考察其抗氧化效果;SRB法测定细胞活力，以细胞内ROS荧光探针DCFH-DA，测定荧光强度以表征细胞内ROS水平，试剂盒测定细胞内SOD和CAT的活力，考察其对细胞内氧化还原状态的影响。结果异甘草素具有强的体外抗氧化作用，并且呈浓度依赖性地抑制Hela细胞的增殖;随异甘草素浓度变化呈现1～7.5 mg/L抗氧化，高于7.5 mg/L浓度促氧化的变化。结论异甘草素浓度依赖性地抑制宫颈癌Hela细胞的增殖;异甘草素低浓度时清除细胞内活性氧，高浓度时促进自由基的生成，促进Hela细胞凋亡。
       【关键词】  异甘草素;体外抗氧化;自由基;活性氧
       Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of isoliquiritigenin(ISL) on the oxidative -reductive state in Hela cells and to study the relationship between the intracellular reactive oxygen species (ROS) and the inhibitory effects on Hela cell proliferation induced by ISL. MethodsThe SRB method was used to determine the effect of ISL on the scavenging rate of hydroxyl radical, DPPH, superoxide anion and on the inhibition rate of lipid peroxidation. The intracellular ROS levels was measured with the fluorescent probe DCFH-DA. The intracellular SOD and CAT activities were detected with commercial test kits.ResultsISL had strong antioxidant activities in vitro and inhibited the proliferation of Hela cells in a concentration-dependent manner. When the concentration of ISL ranged from 1 to 7.5 mg/L, ISL inhibited the proliferation of Hela cells, howerer, ISL can exert the effect of pro oxidation when its concentration was higher than 7.5 mg/L. ConclusionISL can inhibit the proliferation of Hela cells in a concentration-dependent way.
       Key words： Isoliquiritigenin;Antioxidant activity; Free radical;Reactive oxygen species
       恶性肿瘤是死亡率极高的人类第二号“杀手”，而宫颈癌是危害广大妇女健康的主要恶性肿瘤之一 [1]。目前临床使用的一些常规治疗方法虽有不错的疗效，但毒副作用较大，具有很大的局限性。探索高效、低毒的抗肿瘤药物成为目前研究的热点。甘草黄酮具有明显的抗肿瘤、抗艾滋病、抗溃疡、抗感染、抗衰老等药理作用，是一类高效的活性成分，具有许多潜在的药用价值[2，3]。研究表明，活性氧和人类几种主要疾病都有关系，医学界广泛接受的一种观点就是由生物、化学、物理等因素引起机体发炎而导致癌症的发生[4]，已有研究证明炎症细胞释放出来的活性氧和活性氮能够导致上皮细胞增生扩散过程中的DNA损伤，从而导致癌症[5]，而抗氧化剂的干预，通过阻断活性氧介导，可抑制癌细胞生长，并促使其凋亡。甘草黄酮类成分有清除活性氧和自由基作用，并且具有诱导产生肿瘤坏死因子的作用。异甘草素(Isoliquiritigenin ，ISL)是甘草黄酮类化合物的一种，具有明显的抗肿瘤、抗氧化活性，可以降低其他化学抗肿瘤药物的毒性，是潜力较大的天然抗肿瘤药物。ISL对人宫颈癌细胞(Hela)作用，国内外均未见报道。本实验考察了ISL体外抗氧化作用和ISL对Hela细胞活力、氧化还原状态的影响，为开发异甘草素抗肿瘤药物提供一定的理论依据。
       1 材料与仪器
       1.1 材料异甘草素,江西本草天工科技有限公司;DMEM, Sigma;SRB, AO均购自北京拜尔迪生物公司; PMSF(苯甲基磺酰氯,北京拜尔迪生物公司) ;超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、过氧化氢酶(CAT)测试盒、均为南京建成生物工程研究所产品;1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(Sigma公司);Tris(北京拜尔迪生物公司);2-硫代巴比妥酸(上海科丰化学试剂有限公司);焦性没食子酸(天津市富宇精细化工有限公司);邻二氮菲(天津市天新精细化工开发中心);菲咯嗪(合肥博美生物科技有限责任公司);亚油酸(Sigma公司);硫氰酸铵(天津科盟化工工贸有限公司);其余试剂均为分析纯。宫颈癌Hela细胞，新疆特种植物药资源教育部重点实验室。
       1.2 仪器多功能酶标仪(Thermo 3001 VARIOSKAN FLASH);AR-2140型万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司制造);CO2培养箱(Forma 3110，USA); TGL20M台式高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司);蔡司荧光倒置显微镜。
       2 方法
       2.1 ISL体外抗氧化方法
       2.1.1 对羟自由基的清除作用 [6]Fenton反应测定羟自由基清除率。空白组：20 μl 7.5 mmol/L邻二氮菲溶液，40 μl 0.15 mol/L的PBS (pH=7.4)，100 μl蒸馏水，20 μl 7.5 mmol/L的硫酸亚铁，20 μl 的1%的H2O2充分混匀。37 ℃水浴中60 min，在536 nm处，测定吸光度为A1;空白对照组：以20 μl 蒸馏水代替H2O2重复上述操作，测定吸光度为A2;样品组：以100 μl 的样品溶液(终浓度为6.25，12.5，25，50，100 mg/L)代替100 μl 蒸馏水重复空白组操作，测定吸光度为A3;样品对照组：40 μl 0.15 mol/L的PBS中加100 μl 的样品， 60 μl 的蒸馏水，测定吸光度为A4;空白参比组：40 μl 0.15 mol/L的PBS加入160 μl 的蒸馏水，测定吸光度为A5，平行测定3 次。清除率(%)=[(A3-A4-A1+A5)/(A2- A1)]×100%
       2.1.2 对DPPH的清除作用[7]100 μl 0.06 mmol/L的DPPH乙醇溶液中加入100 μl样品溶液(终浓度为6.25,12.5,25,50,100 mg/L)，分别计算清除率。清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%式中：A0为DPPH溶液100 μl +无水乙醇100 μl 的吸光度;A1为DPPH溶液100 μl +样品溶液100 μl 的吸光度;A2为样品溶液100 μl +无水乙醇100 μl 的吸光度。
       2.1.3 对超氧阴离子的清除作用 [8]取浓度为0.05 mol/L的Tris-HCl(pH=8.2)缓冲液100 μl，25 ℃预热20 min，加入50 μl样品溶液(终浓度为6.25, 12.5, 25, 50, 100 mg/L)，立即加入40 μl 的3 mmol/L的邻苯三酚，振荡使之充分反应，4 min后，用10 μl 的3 mol/L的HCl终止反应，在325 nm处测定吸光度(A1)，平行测定3次。模型对照组(A0)用50 μl 的蒸馏水代替样品液。空白对照组(A2)用40 μl的蒸馏水代替邻苯三酚。清除率(%)=[(A0-A1+ A2)/A0]×100%
       2.1.4 对卵黄脂质过氧化抑制能力的测定[9]20 μl蛋黄(4% V/V)与20 μl样品(6.25，12.5，25，50，100 mg/L)，20 μl 的7.5 mmol/L的硫酸亚铁，用pH=7.4，0.1 mol/L的PBS补至200 μl。振荡15 min后，加入50 μl 的20%的TCA，5 740 g离心8 min，吸取100 μl 上清液加入50 μl 0.8%TBA，沸水浴15 min，在532 nm处测吸光度A，平行测定3次。以不加样品管的吸光度为A0，以样品加PBS管的吸光度为A1。
       2.2 SRB法测定细胞活力Hela细胞加于培养板培养24 h后，加ISL(终浓度2.5，5，10，15，20 mg/L)处理，培养24 h，加入预冷的50 μl 50 % TCA，置于4 ℃冰箱中冷藏固定1 h，自来水洗后，空气中干燥。干燥后加0.4 % SRB染色15 min，然后用1 % 醋酸洗涤，自然干燥，然后每孔加 pH为10.5，10 mmol/L Tris 150 μl，在平板振荡器上振荡5 min，用酶标仪测定490 nm 处OD值。药物对肿瘤细胞的抑制率按下式计算：抑制率(%)=给药组OD值-空白组OD值给药组OD值-空白组OD值×100%　　根据药物浓度对应细胞增殖抑制率作线性回归，根据直线方程计算药物对细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)。
       2.3 DCFH-DA测定细胞内ROS水平 加浓度为1.0×105细胞/孔于96孔培养板中，培养24 h后，加药处理0.5，1.0，2.0 h，加DCFH-DA至终浓度为30 μmol/L，总体积为200 μl，孵育30 min后，酶标仪测定荧光强度，激发光为485 nm，发射光为525 nm。
       2.4 细胞内SOD和CAT活力的测定Hela细胞传代培养于培养瓶，按ISL终浓度1.0，2.5，5.0，7.5，15 mg/L，每个浓度在0.5，1，2，4，8，16 h 收集细胞后，用预冷的PBS(4℃)漂洗2次，加入200 μl细胞裂解液反复冻融3次，于-70℃贮存备用。　　取出细胞裂解液，于4℃，16 000 r·min-1离心20 min，按SOD和CAT测定试剂盒说明书，测定不同时间点和不同浓度细胞的SOD和CAT的活力。
       3 结果
       3.1 ISL体外抗氧化作用ISL对羟自由基，DPPH，超氧阴离子和脂质过氧化的体外清除率IC50值(见表1)。在6.25～100 mg/L浓度范围内，ISL、抗坏血酸和维生素E对羟自由基，DPPH，超氧阴离子和脂质过氧化清除能力都呈现出浓度依赖性关系。ISL对羟自由基的清除活性始终低于抗坏血酸高于维生素E(见图1)。ISL使DPPH溶液由紫色转变为黄色，表明ISL能够有效地清除DPPH自由基，但是70 mg/L以下的浓度表现出低于抗坏血酸和维生素E的活性，高于70 mg/L表现出高于维生素E的活性但低于抗坏血酸(见图2)。在清除超氧阴离子实验中，ISL表现出比抗坏血酸和维生素E更强的活性(见图3)。抑制脂质过氧化，ISL的IC50值为13.5 mg/L，而抗坏血酸和维生素E分别为49.8 mg/L和22.2 mg/L;当药物剂量浓度高于10 mg/L时，ISL抑制脂质过氧化的能力显著高于抗坏血酸和维生素E(见图4)。以上结果表明，ISL在清除自由基方面具有明显的作用，自由基的清除也伴随着增加的剂量依赖关系。表1 体外抗氧化IC50值比较图1 ISL、抗坏血酸、维生素E对 图2 ISL、抗坏血酸、维生羟自由基清除率 素E对DPPH清除率图3 ISL、抗坏血酸、维生素E 图4 ISL、抗坏血酸、维生对超氧阴离子清除率 素E对脂质过氧化抑制率
       3.2 细胞活力测定采用不同浓度ISL处理Hela细胞，用SRB法测其活力。由图5可知，2.5～10 mg/L范围内，ISL对Hela细胞的抑制随其浓度的增加而增加;ISL浓度大于10 mg/L后，对Hela的抑制率增加变化平缓。图5 ISL对Hela细胞 图6 ISL对Hela细胞内抑制率影响 ROS水平的影响
       3.3 细胞内活性氧水平ISL处理Hela细胞2，4，8 h后，以DCFH-DA荧光探针测得的细胞内ROS水平，药物浓度在1～7.5 mg/L时，各时间点均浓度依赖性地减少了细胞内ROS，更高浓度(15 mg/L)却明显提高了细胞内ROS水平(见图6)，表明ISL对细胞内ROS水平具双向调控作用。
       3.4 细胞内SOD和CAT活力使用不同浓度ISL处理Hela细胞不同时间，细胞内SOD和CAT活力单位均表现出不同浓度ISL处理条件下4 h处理时间两者活力最高;并且同时反映出在接近ISL对Hela细胞IC50值附近的浓度7.5 mg/L使细胞内SOD和CAT活力上调至最大，随后表现出下降趋势(见图7～8)。这一结果与细胞内活性氧水平的表达相一致。图7 ISL对Hela细胞内 图8 ISL对Hela细胞内SOD水平的影响 CAT水平的影响
       4 讨论
       目前广泛的观点认为，肿瘤的发生、凋亡与活性氧自由基密切相关。通过自由基的链式反应，可以在自由基的产生部位及远离的其它部位，攻击包括DNA、蛋白质、脂质等生物分子。活性氧是与生物体相关的自由基中重要的一类。本实验采用化学方法测定ISL抗氧化能力与细胞内自由基含量、清除自由基酶类(SOD、CAT)活力相结合，来探讨ISL对Hela细胞氧化还原水平的影响。
       ISL作为一种多羟基黄酮类化合物表现出较强的抗氧化活性，其对羟自由基、DPPH、超氧阴离子具有清除作用尤其是对脂质过氧化有强的抑制作用，可能是其在生物体内抑制环氧合酶、脂氧合酶、过氧化物酶的活性，抗血小板凝集，起到抗炎作用的机理。NF-κB是慢性炎症相关肿瘤行成不可缺少的因子，ROS的氧化应激可调节NF-κB的激活，ISL可能通过减少细胞内的氧化应激反应，可以达到预防炎症相关肿瘤的发生。
       超氧化物歧化酶( SOD)和过氧化氢酶(CAT)都属于细胞的初级防御体系，也都具有清除自由基的作用，其活性不仅能够反映细胞损伤的原因，还可以判断细胞损伤的程度。在抗肿瘤药物的作用下,它们多表现为活性下降趋势。本研究表明，伴随ISL浓度的增加, SOD的活性呈现先上升后下降的趋势，说明ISL在Hela细胞内低浓度下起到清除自由基抗氧化的作用，高浓度时促进了细胞内自由基的生成，表现出细胞毒性，诱导细胞凋亡。
       具有雌激素样作用的ISL，对人乳腺癌细胞MCF-7和宫颈癌细胞Hela的增值起到抑制作用，并且发现ISL的抗增值作用具有双向性：在中低浓度时，可促进MCF-7细胞增殖，而在高浓度时表现出细胞毒性。本研究中ISL在1～7.5 mg/L浓度范围，Hela细胞内自由基含量降低，高于7.5 mg/L浓度则促进细胞内自由基生成，导致Hela细胞凋亡这一结果与以上表述相一致。
       ISL对前列腺癌、人肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞有抗增殖作用。本实验ISL对Hela细胞内氧化还原状态的影响，表明ISL对细胞内自由基生成的双向作用，为ISL对Hela细胞治疗的进一步研究提供理论基础。
       【参考文献】
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