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       【摘要】 
       目的建立一种测定赤小豆中总黄酮含量的方法，为赤小豆的质量控制提供科学依据。方法以芦丁为对照品，亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定赤小豆总黄酮含量。结果线性方程为A=11.402C-0.004 9，相关系数r=0.999 9，平均加样回收率为100.55%，RSD为1.36%(n=6)。对全国11个省的37个不同产地的药材中总黄酮含量进行了测定，赤豆含量为0.76%～1.31%，赤小豆含量为0.84%～1. 30%。结论该测定方法准确，重复性好，可用于赤小豆药材中总黄酮的含量测定。
       【关键词】  赤小豆; 赤豆; 总黄酮; 芦丁; 分光光度法
       Abstract：ObjectiveTo develop a UV-VIS analysis method for the determination of total flavonoids in adzuki bean，in order to provide a scientific basis for the quality control of adzuki bean. MethodsWith rutin as standard sample, sodium nitrite - aluminum nitrate colorimetric method was used to determine the content of total flavonoids in adzuki bean.ResultsThe calibration curve of rutin was A=11.402C-0.004 9, r=0.999 9, and the average recovery was 100.55%,with RSD of 1.36%(n=6). The content range of total flavonoids in Phaseolus angularis was from 0.76% to 1.31%, and content range in P. calcaratus was from 0.84% to 1.30%.ConclusionThis detemination method is practical，reproducible and can be used for evaluating the quality of adzuki bean.
       Key words： Adzuki bean; Total flavonoids; Rutin; UV-VIS spectrophotometry
       赤小豆为豆科植物赤小豆Vigna umbeuata Ohwi et Ohashi或赤豆Vigna angularis Ohwi et Ohashi的干燥成熟种子，具有利水消肿，解毒排脓的功能[1]。赤小豆既是常用中药，又是我国广泛食用的豆类。中国的赤小豆资源极其丰富，是产量最多，出口量最大的国家。赤小豆始载于《神农本草经》，列为中品，其后历代本草、医方亦多有记载。现代药理研究表明，赤小豆具有抗氧化、增强免疫、抗菌、雌激素样作用等药理作用，广泛应用于临床治疗急性肾炎、肝硬化腹水、水痘、腮腺炎、炎性外痔、皮肤病等[2]。在中药材安全性被日益关注的今天，其药食同源的优点使其备受青睐。赤小豆主要含有五环三萜皂苷类、黄酮类、鞣质等化合物。其黄酮类化合物具有较强的体外抗氧化作用，对Fe2+导致的大鼠原代肝细胞氧化损伤具有保护作用，是预防和治疗肿瘤、肝病等疾病的有效成分[3]。《中国药典》现行版收载赤小豆质量标准极不完善，缺乏内在质量量化指标。本文用亚硝酸钠-硝酸铝显色法建立赤小豆总黄酮含测方法，并对全国11省37个产地的赤豆、赤小豆总黄酮含量进行了测定，为完善制定赤小豆质量标准奠定基础。
       1 仪器与材料
       1.1 材料赤豆药材29份，赤小豆药材8份，由成都中医药大学闫婕、郭山山、王化东等自采或购于全国11个省区，经成都中医药大学卫莹芳教授鉴定为豆科植物赤豆Vigna angularis Ohwi et Ohashi或赤小豆Vigna umbeuata Ohwi et Ohashi的干燥成熟种子。
       1.2 仪器UV-1100紫外-可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)，DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)，KQ-3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP121S电子天平(万分之一 Startorius德国赛多利斯股份公司)，BP211D电子天平(十万分之一 Startorius德国赛多利斯股份公司)。
       1.3 试药芦丁对照品(批号：100080-200707，购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用);其他试剂均为市售分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 显色方法及测定波长的选择精密吸取芦丁对照品溶液和供试品溶液适量，用亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行显色，以空白试剂为对照，于200～800 nm波长范围内进行扫描，在500nm处有最大吸收，故选500 nm为测定波长。见图1。
       2.2 对照品溶液的配制取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品25 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取20 ml，置50 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得每毫升中含无水芦丁0.2 mg的芦丁对照品标准溶液。
       2.3 标准曲线的绘制精密量取对照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，分别置25 ml量瓶中，各加水至6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，在500 nm波长处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C(mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线。得到回归方程为A=11.402C-0.004 9，r=0.999 9，芦丁在0.008 184～0.049 104 mg/ml浓度范围内，吸光度与浓度呈良好线性关系。见图2。图1 赤豆最大吸收波长光谱图图2 芦丁标准溶液标准曲线
       2.4 精密度实验精密吸取芦丁对照品溶液适量于具塞试管中，平行6份，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。测定结果的RSD为0.98%，仪器的精密度较好。
       2.5 稳定性实验精密吸取芦丁对照品溶液适量于具塞试管中，按照“2.3”项下方法显色，显色后放置5，10，15，30，45，60，90，120 min后，吸光度分别为0.487，0.486，0.484，0.483，0.480，0.479，0.475，0.472。结果表明该显色反应在5～120 min内较稳定。
       2.6 重复性实验取同一批赤小豆样品约1.0 g，平行6份，精密称定，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。6次重复试验的测定结果平均值为0.630，RSD为1.39%，该方法有较好的重复性。
       2.7 加样回收率实验精密称取芦丁对照品25.03 mg，用70%乙醇定容于50 ml量瓶中备用。称取已知含量的赤豆粉末0.5g，平行6份，精密称定，精确加入新制备的对照品溶液5 ml，混匀，加入70%乙醇35 ml，水浴回流1.5 h，滤过，滤液转移置50 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，精密吸取5 ml至25 ml量瓶中，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。结果见表1。平均加样回收率为100.55%，RSD为1.36%(n=6)。表1 加样回收率实验结果
       2.8 供试品溶液制备方法的选择
       2.8.1 提取溶剂考察取同一赤豆粉末约1.0g，平行8份，精密称定，分别加入30%乙醇，50%乙醇，60%乙醇，70%乙醇，80%乙醇，水，甲醇，40%甲醇各25 ml，超声提取20 min，滤过，精密移取滤液3 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。结果(见表2)表明，采用不同提取溶剂，吸光度的差异较大，水和甲醇做溶剂的吸光度极低，50%以下浓度的乙醇难以过滤。
       2.8.2 溶剂用量考察取同一赤豆粉末约1 g，平行4份，精密称定，各加8，16，25，50倍量70%乙醇，分别超声提取20 min，滤过，精密移取滤液5 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。结果表明，溶剂用量对吸光度有较大影响，随着溶剂用量的增加，吸光度也相应增加。见表3。表2 提取溶剂的考察结果　表3 溶剂用量的考察结果
       2.8.3 提取方法考察取同一赤豆粉末约1 g，平行2份，精密称定，各加25 ml 70%乙醇，分别以超声、回流提取30 min，滤过，精密移取滤液3 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。吸光度分别为0.304，0.611。结果表明，相同条件下，回流提取方法要明显优于超声提取。
       2.8.4 提取时间考察取同一赤豆粉末约1 g，平行4份，精密称定，各加25 ml 70%乙醇，分别以80℃回流提取30 min，1，1.5，2 h，滤过，精密移取滤液3 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。结果(见表4)表明，提取时间为0.5 h的吸光度最低。表4 提取时间的考察结果
       2.8.5 回流温度取同一赤豆粉末约1 g，平行4份，精密称定，各加25 ml 70%乙醇，分别在60，70，80，90℃水浴温度下回流1 h，滤过，精密移取滤液3 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。吸光度分别为0.521，0.576，0.550，0.530。结果表明，70～80℃为最佳回流温度。
       2.8.6 pH值取同一赤豆粉末约1 g，平行4份，精密称定，各加25 ml 70%乙醇，分别调节pH值到6，7，8，9，10，于80℃水浴温度下回流1 h，滤过，精密移取滤液3 ml，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。吸光度分别为0.579，0.550，0.571，0.503。结果表明，不同pH值，对吸光度影响不大。
       2.8.7 正交实验根据单因素实验的结果，选择乙醇浓度(A)、溶剂量(B)、提取时间(C)为3个因素，每个因素选用3个水平设计“乙醇回流提取因素水平表”，见表5。以用L9(34)正交表任意安排因素，作3次重复实验。取同一赤豆粉末约1 g，精密称定，置锥形瓶内，按因素水平表及正交设计表进行乙醇回流提取，提取液过滤，滤液转移至50 ml容量瓶中，加适当的溶剂至刻度，摇匀，作为供试品储备液。精密量取储备液5 ml，置25 ml容量瓶中，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。采用SPSS15.0对试验结果进行正交设计试验分析，以确定最佳提取条件，结果见表6。表5 乙醇回流提取因素水平表6 乙醇回流提取正交设计及试验结果吸光度越大，黄酮的提取率就越高。方差分析表明，乙醇浓度(A)、溶剂量(B)对黄酮提取率有极显著影响(P<0.01)，提取时间(C)对黄酮提取率无显著影响(P>0.05)。重复试验P>0.05，三次重复实验无显著差异。直观分析R值表明，影响赤豆提取率的主次因素分别为B>A>C，最佳提取工艺是A2B3C2，即用70%的乙醇35 ml，回流提取1.5 h。
       2.9 不同产地赤豆、赤小豆样品中总黄酮的含量测定取各个产地的赤小豆及赤豆药材粉末约1.0 g，精密称定，置250 ml锥形瓶中，加70%乙醇35 ml，于水浴温度75℃回流提取1.5 h， 放冷，过滤，滤液转移至5 0ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，作为供试品储备液。精密量取5 ml供试品储备液置25 ml容量瓶中，按照“2.3”项下方法显色测定吸光度。根据标准曲线计算供试品溶液总黄酮含量。结果见表7。
       3 讨论
       总黄酮是赤小豆抗氧化、预防各种慢性疾病的活性成分。本文建立了亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定赤小豆药材中总黄酮的含量的方法，并研究了赤小豆总黄酮的制备方法，对提取方式、提取溶剂、溶剂用量等进行考察，最终确定提取条件为用35倍量的70%的乙醇，回流提取1.5 h。方法学研究结果表明，该含量测定方法准确度高、重复性好(RSD为1.39%)，加样回收率为100.55%，RSD为1.36%。因此本方法可作为赤小豆总黄酮的含量测定方法。表7 全国不同产地赤豆、赤小豆总黄酮的含量全国8省，29个产地赤豆样品中总黄酮的含量在0.76%～1.31%，陕西省平遥县西善乡的总黄酮含量高于其他地区，达1.31%，四川省荷花池药材市场购德阳产商品的含量最低，只有0.76%。全国5省，8个产地的赤小豆样品中总黄酮的含量在0.84%～1.30%，购于清平药材市场的总黄酮含量最高，为1.30%，贵州省黔东南苗族侗族自治区的含量最低，为0.84%。建议赤小豆药材总黄酮含量不得低于0.80%。
       当年自采的样品大多含量较高，商品药材有些含量偏低，是否与商品药材贮藏时间久，虫蛀现象有关，值得深入研究。药用赤小豆的贮藏方法及贮藏年限需要进一步加以规范。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：147.
       
       [2] 肖培根.新编中药志(二)[M].北京：化学工业出版社， 2001：248.
       
       [3] 李 波，赵青威，Nadine Weber，等.赤豆荚果总黄酮提取物对原代培养大鼠肝细胞氧化损伤的保护作用[J].营养学报，2005，27(5)：397.