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       【摘要】 
       目的探讨何首乌多糖、二苯乙烯苷及何首乌含药血清对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖的影响。方法分离、培养大鼠MSCs，分别加入何首乌多糖、二苯乙烯苷及何首乌含药血清72 h后，MTT法检测大鼠MSCs增殖情况。结果10-4 mol/L二苯乙烯苷及10%何首乌含药血清对大鼠MSCs增殖的影响，与空白组及空白血清组比较，差异有显著性意义(P<0.05)，不同浓度的何首乌多糖对大鼠MSCs增殖影响不明显。结论二苯乙烯苷及何首乌含药血清可促进大鼠MSCs增殖。
       【关键词】  何首乌; 二苯乙烯苷; 含药血清; 骨髓间充质干细胞; 细胞增殖
       Abstract：ObjectiveTo discuss the effect of Polygonum multiflorum polysaccharide, tetrahydroxystilbene glycoside and Pohygonum mutifilorum medicated serum on proliferation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs).MethodsMSCs were isolated from rat bone and cultured under Polygonum multiflorum polysaccharide, tetrahydroxystilbene Glycoside or polygonum multiforum medicated serum for 72h.After the induction, the proliferation effect on MSCs was detected with MTT. ResultsCompared with the control group and blank serum group, 1×10-4mol/L tetrahydroxystilbene glucoside and 10% Polygonum multiflorum medicated serum had obvious effect on rat MSCs, and the difference was significant(P<0.05). ConclusionTetrahydroxystilbene glucoside and Polygonum multiflorum medicated serum can promote the proliferation of MSCs.
       Key words：Polygonum multiflorum; Tetrahydroxystilbene glucoside; Medicated serum; Mesenchymal stem cells; Cell proliferation
       干细胞具先天之精属性，是先天之精在细胞层次的存在形式[1～3]。MSCs是存在于骨髓中的一类多能干细胞，是组织工程及细胞和基因治疗的重要靶细胞，但骨髓中MSCs的含量极少，必须在体外培养扩增才能满足要求。因此，我们的研究从补肾益精的中药何首乌入手，探讨何首乌有效成分、含药血清对MSCs增殖的影响，也为干细胞与肾精理论提供有力的药理学依据。
       1 材料与仪器
       1.1 药物何首乌多糖购自惠州仙草公司、二苯乙烯苷购自四川曼斯特公司、何首乌购自广州中医药大学附属第一医院中药房，临用时以低糖培养基配制。
       1.2 动物SD大鼠，雄性，体质量120～150g，用于MSCs细胞的提取;SD大鼠，雌性，体质量220～250 g，用于含药血清的制备。由广东省医学实验动物中心提供，合格证编号：粤监证字2008A020。
       1.3 试剂特级胎牛血清(Gbico，美国)、青/链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶-EDTA、PBS缓冲液、DMEM低糖培养液(吉诺生物医药技术有限公司，杭州)、四甲基偶氮唑盐MTT、二甲基亚砜DMSO(Amresco，美国)。
       1.4 仪器酶标仪(Bio-Rad，美国);二氧化碳孵育箱(ThermoForma，美国)。
       2 方法
       2.1 何首乌含药血清的制备常法制备成含生药2 g/ml的浓煎液，实验组的用药剂量相当于临床等效剂量(根据“实验动物与人按体表面积比等效计量换算比率表”[4]计算)的10倍，对照组灌服生理盐水。各组大鼠每日2次灌胃，连续3 d灌胃后，第4天1次服用全天剂量。腹主动脉取血，离心取上清。56℃，30 min 灭活后，经0.22 μm 针头微孔滤器过滤除菌，-70℃冰箱保存备用。从而制备出含药血清及对照血清。
       2.2 含药培养基的制备称取80 mg何首乌多糖，加入8 ml DMEM培养基，搅拌使之充分溶解后，即成10mg/ml母液。称取二苯乙烯苷5 mg，加入适量 DMEM培养基，搅拌使之充分溶解后，即成10-3mol/L母液。后续实验中根据需要稀释成相应的不同浓度含药培养基。用0.22μm针头滤器过滤除菌，分装，-20℃避光保存。
       2.3 MSCs的分离与培养颈椎脱臼处死大鼠，无菌条件下分层剥离后肢皮肤、附着肌肉， 剪断胫、股骨的骨骺端， 用10%胎牛血清的完全培养液反复冲洗骨髓腔。收集细胞悬液，接种于25 cm2 培养瓶中，置37℃、5%CO2 恒温培养箱中培养;原代MSCs 培养48 h 后进行首次换液， 以后每3天换液1 次。培养7～10 d 后，细胞铺满瓶底约80%～90%。此时加入PBS缓冲液冲洗，再用0.25%的胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于新培养瓶中进行扩增培养。常规按1∶2或1∶3比例传代。
       2.4 MTT法细胞活性检测取生长良好的第3代MSCs，制备单细胞悬液，以1×104个/ml均匀地接种于一次性96孔培养板上，每孔200 μl。24 h细胞贴壁后吸弃培养基。何首乌多糖、二苯乙烯苷组依次加入用10%完全培养基配好的不同浓度含药培养基，空白组加10%完全培养基。空白血清组、何首乌含药血清组分别添加血清后，使各组血清浓度分别为培养液体积的5%，10%，15%，20%，25%，30%。每组6个复孔。各组同时培养达72 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)溶液20 μl，继续培养4h，弃上清，每孔再加入DMSO 150 μl，振荡10min，选择490nm波长测定各孔光吸收值。
       3 结果
       3.1 何首乌多糖对MSCs增殖的影响何首乌多糖诱导培养72 h后，与空白组相比，不同浓度何首乌多糖对MSCs的促增殖作用不明显(P>0.05)。结果见表1。表1 何首乌多糖对MSCs增殖的影响
       3.2 何首乌含药血清对MSCs增殖的影响何首乌含药血清诱导培养72h后，与空白血清组相比，10%何首乌含药血清对MSCs的增殖具有明显促进作用(P<0.05)。其他浓度何首乌多糖含药血清对MSCs的促增殖作用不明显(P>0.05)。结果见表2。表2 何首乌含药血清对MSCs增殖的影响
       3.3 二苯乙烯苷对MSCs增殖的影响二苯乙烯苷诱导培养72 h后，与空白组相比， 10-4 mol/L二苯乙烯苷对MSCs的增殖具有明显促进作用(P<0.05)。其他浓度二苯乙烯苷对MSCs的促增殖作用不明显。结果见表3。表3 二苯乙烯苷对MSCs增殖的影响
       4 讨论
       MSCs揭示了细胞增殖、分化、生物发育机制等基本的生命规律。肾精也是描述人体构造与生长、发育、衰老过程的基本理论。二者对细胞生命过程的调控非常相似，只是中西医学各自理论的阐述有所不同，研究的角度也有微观与宏观的差异。因此，通过补益肾精，有可能促进MSCs的增殖分化，充分发挥其自我更新的潜力。
       MSCs由于具有多能性、高增殖潜力及易获取、易培养的优越性，使其在干细胞生物学基础研究、细胞和基因治疗研究以及在组织工程的应用研究方面，有着极大价值。但成人骨髓平均10万个有核细胞中仅含有1个，并随着年龄的增加，细胞数量逐渐减少[5]。MSCs的增殖仍是临床应用的难题。目前关于MSCs的增殖研究，国内外大部分集中于细胞因子对MSCs的影响，利用传统中药及其有效成分诱导MSCs的增殖研究较少。
       何首乌Polygonum multiflorum，又名野苗、交藤、交茎、夜合、地精、赤葛等，归肝、肾经，为补益精血的要药。《开宝本草》称何首乌“久服长筋骨，益精髓，延年不老”。《本草纲目》记载，“养血益肝，固精益肾，健筋骨，乌髭发，为滋补良药”。近年来有关何首乌含药血清、提取物、有效成分的研究多集中在抗氧化、脑保护等方面[6～8]，涉及细胞方面较少，有关干细胞的研究尚未见报道。
       何首乌主要含有二苯乙烯苷、蒽醌和磷脂等三大类成分。二苯乙烯苷是一类具有多种生理活性的天然成分，已成为何首乌的标志性成分，是药典对何首乌进行质量控制的指标性成分，其含量一般不少于干药材的1%[9]。何首乌多糖作为植物何首乌块根中提取到的一种新活性成分，目前已成为何首乌研究的又一亮点。近年来对何首乌多糖的生物活性评价研究表明，何首乌多糖具有免疫调节、抗氧化、抗衰老及抗老年痴呆症等的活性作用[10]。本研究结果表明，10-4 mol/L二苯乙烯苷对MSCs的增殖具有明显促进作用(P<0.05)，不同浓度何首乌多糖对MSCs的增殖无明显影响。
       中药血清药理学方法克服以往中药体外实验的不利因素，比中药直接体外实验有较多的优势，能较客观和真实地阐明中药的药效和作用机制[11]。本实验采用何首乌含药血清代替进行体外实验，使反应体系更接近于动物体内环境。研究结果表明，与空白血清组相比，10%何首乌含药血清对MSCs的增殖具有明显促进作用(P<0.05)。
       中药结构复杂，成分多样，作用靶点丰富，且体内实验和体外实验效果存在不一致性。因此，我们从补肾中药何首乌含药血清、有效成分二苯乙烯苷、多糖等各方面入手，力求从多方面、多层次、多角度对何首乌与MSCs之间的关系作出有益的探索。目前研究尚处于初级阶段，有待于进一步全方位探索其作用机理。
       【参考文献】
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