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       【摘要】 
       目的观察六月青(Liuyueqing，LYQ)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法采用血清药理学方法，在HBV的体外细胞培养系统中(2.2.15细胞)进行LYQ抗HBV cccDNA作用观察。结果LYQ含药血清在HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞HBV cccDNA的复制，其作用呈明显的量效和时效反应关系。结论LYQ在体外有明显的抑制乙肝病毒的作用。
       【关键词】  六月青; 乙型肝炎病毒; HepG2.2.15细胞; HBV cccDNA
       Abstract：ObjectiveTo study the anti-HBV activity of Liuyueqing (LYQ) in vitro. MethodsThe HBV in vitro cell culture system(HepG2.2.15 cell) was used for examining the anti-HBV activity of LYQ with Serum-pharmacology. ResultsThe serum containing LYQ could decrease the HBV DNA level in HepG2. 2. 15 cells, and its inhibitory effects were dose-and time-dependent. ConclusionLYQ can inhibit HBV DNA in vitro significantly.
       Key words：Liuyueqing; HBV ; HepG2.2.15 cell; HBV cccDNA
       六月青(Liuyueqing，LYQ)系爵床科(Acanthaceae)植物肖鸡笼(顶花马兰)Taraphochlamys affinis (Gr iff) Bremekhu [Strobilanthes affinis (Griff) Y.C.Tang]的干燥地上部分[1]。本课题组前期研究发现，六月青含药血清对HepG2.2.15细胞系HBsAg-HBeAg有明显抑制作用[2]，其总皂苷对HBV-DNA的复制有显著的抑制作用[3]。本实验研究六月青含药血清对HepG2.2.15细胞HBV cccDNA的作用，进一步探讨六月青抗乙肝作用机制。
       1 材料与仪器
       1.1 药物六月青(Liuyueqing，LYQ)采于广西灵山，由广西中医学院一附院黄权芳中药师鉴定，其水提物由广西医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中心提取。
       1.2 动物Wistar大鼠，雌雄各半，体质量(250±10)g，实验动物使用许可证号：SYKG桂2003-0005;实验动物生产许可证号：SCXKG桂2003-0003;由广西医科大学实验动物中心提供。
       1.3 细胞株HepG2.2.15细胞株(北京医科大学第一附属医院病毒研究所)，本室自行传代，定期用G418筛选。
       1.4 试剂阿昔洛韦(Aciclovir，ACV湖南迪诺制药有限公司医药工业研究所产品，批号: 20070518);RPMI1640培养基(美国Gibco公司，Cat　No.21202-016);胎牛血清(美国Gibco公司，Cat No.21607-042);G418(美国Sigma公司，Cat No.228527-72); QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒(Qiagen公司，No.127141405);HBV DNA荧光定量PCR试剂盒(深圳匹基生物工程股份有限公司，批号：20070613);SYBR Green PCR Kit(Qiagen公司，No.127144035)。
       1.5 仪器iCycler FQ实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司);CO2孵箱(美国Thermo　Forma公司，Model311)。
       2 方法
       2.1 LYQ含药血清的制备3月龄Wistar大鼠50只，随机分为5组，每组10只。①空白对照组：等量的生理盐水;②阳性对照组：ACV 0.1 mg·kg·d-1;③LYQH组：6.6 g·kg·d-1;④LYQM组：3.3 g·kg·d-1;⑤LYQL组：1.7 g·kg·d-1。各组动物在同样条件下饲养，均以2次/d，早晚各1次空腹灌胃，连续给药7 d。于末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12h)后2 h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并将每组动物的血清混合。经56℃ 30 min灭活处理，经0.45 μm的微孔滤膜，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，置-20℃冰箱保存备用。
       2.2 引物合成P1：ACCGTGTGCACTTCGCTFC，P2：AGTAGGACATGAACAAGAGATGATTAGG;另一对引物，其正义引物与反义引物均位于负链缺口下游双链区域，可同时扩增：rcDNA和cccDNA。P3：GCCTCCAAGCTGTGCCTFG，P4：TCTGCGACGCGGCGATrGAG。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
       2.3 细胞的培养取HepG 2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104cell·ml-1，加入24孔细胞培养板，每孔900 μl，置CO2孵箱(37℃，5%CO2)中培养24 h后，分别加入各组含药血清100 μl，每个浓度3个复孔。以等量的完全培养液为空白对照。连续培养72 h后，分别吸出上清液于1.5 ml灭菌Eppendor管中， -20℃保存，统一待检。再次加入上述含药血清的培养液继续培养72 h后，分别吸出上清液于1.5 ml灭菌Eppendorf管中， -20℃保存，统一待检。
       2.4 HBV ccDNA的提取 取细胞样本，离心去上清液， 用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒抽提cccDNA ， 按试剂盒说明书操作。cccDNA产物溶于50 ml pH8.0 的TE溶液。测定提取物吸光度A260nm和A280nm， 根据A260和A280的比值计算样品的DNA纯度。
       2.5 酶切cccDNA 取cccDNA提取物10 μl，用绿豆核酸酶酶切。37℃温育25 min，用2 μl 100mmol·L-1的EDTA(pH 7.4)灭活绿豆核酸酶。
       2.6 PCR扩增[4]取5 μl样品，加入PCR试剂和引物，各反应管放入FQ-PCR仪，按以下条件进行扩增：94℃预变性1 min，95℃变性5 s，60℃退火、延伸20 s。共反应42个循环。扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成。
       2.7 统计学处理采用SPSS10.0统计软件分析数据，组间比较采用方差分析。
       3 结果
       与空白对照组比较，LYQ中、高剂量含药血清作用72，144 h后，HepG2.2.15细胞上清液中HBV cccDNA的拷贝数明显降低(P<0.05或P<0.01)，提示对HBV cccDNA具有显著的抑制作用，并且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。结果见表1。表1 YLQ含药血清对HepG2.2.15细胞HBV cccDNA的抑制作用
       4 讨论
       目前慢性乙型肝炎已成为危害人类健康的主要疾病。分子生物学研究表明，HBV-DNA的复制机制复杂且独特，其复制周期开始于共价环状闭合DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，以其为模板利用宿主细胞的酶转录为前基因组RNA，逆转录为负链DNA，再合成正链DNA，双链DNA又成熟为cccDNA，是一个连续的过程。cccDNA水平的高低与病情复发密切相关。因此检测cccDNA的表达，不仅可作为评价药物疗效的重要指标，对病情的诊断及用药指导也有重要的意义。
       中药是祖国医学的宝贵财富，其中不乏对乙肝病毒有效的药物。本课题组之前的研究显示，六月青含药血清对HepG2.2.15细胞系HBsAg、HBeAg有明显抑制作用[2]，其总皂苷对HBV-DNA的复制也有显著的抑制作用[3]，提示六月青体外有较好的抗HBV作用。本实验结果表明，LYQ中、高剂量含药血清作用72，144 h后，HepG2.2.15细胞上清液中HBV cccDNA的拷贝数明显降低(与空白对照组比较，P<0.05或P<0.01)，提示对HBV cccDNA具有明显的抑制作用，并且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。
       本研究通过体外实验进一步证实了六月青有良好的抗乙肝病毒活性。虽然其确切机制尚待阐明，但我们的研究结果表明，六月青是一有良好研发前景的抗HBV药。
       【参考文献】
         　[1] 林 兴，黄权芳，李 江，等. 广西民间药六月青的性状与显微鉴定[J].中药材，2005，28(7)：541.
       
       [2] 林 兴，黄权芳，张士军，等. 六月青含药血清对HepG2.2.15细胞系HBsAg与HBeAg表达的影响[J].时珍国医国药，2009，20(7)：1603.
       
       [3] 林 兴，黄权芳，张士军，等. 六月青总皂苷对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用[J].时珍国医国药，2009，20(11)：2728.
       
       [4] 彭忠田，申 璀，谭德明，等.脱氧野尻霉素衍生物抗乙型肝炎病毒的体外试验研究[J].中国药房， 2007，18(1)：22.