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       【摘要】 
       目的观察严重烧伤大鼠心肌细胞内质网应激蛋白表达的改变及川芎嗪对其的影响，探讨川芎嗪对严重烧伤后心肌损伤保护作用机制。方法建立大鼠30%Ⅲ度烫伤模型，酶联免疫法检测血浆中心肌肌钙蛋白T(cTnT)含量，放射免疫法检测血浆中TNF-α的含量，RT-PCR和免疫组化分析GRP94的表达。结果烧伤组大鼠伤后3 h血浆中cTnT含量即呈显著升高(P<0.01)，心肌中GRP94 mRNA和蛋白表达于烧伤后3 h显著性升高，12 h达峰值，24 h还显著升高; Caspase-3活性在伤后3 h升高，12 h达高峰，48 h后仍显著高于对照组。川芎嗪治疗组GRP94的表达和Caspase-3活性较烧伤组均有显著性降低(P<0.05)。结论严重烧伤可引起心肌细胞内GRP94表达呈持续性升高，川芎嗪对烧伤后早期GRP94表达升高有较好的拮抗作用。
       【关键词】  烧伤; 川芎嗪; 葡萄糖调节蛋白; 心肌损伤; 内质网应激
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of liqustazine on expression change of glucose-regulated protein 94 (GRP94) in the cardiomyocytes of severe burn rats. MethodsHealthy adult Wistar rats were randomly divided into the control group(without burns)， the burn group (subjected to 30%TBSA III degree scalding) and the treatment group (treated with intraperitoneal injection of Liqustazine (20 mg/kg) immediately after scald injury). The myocardial tissue samples were harvested at 1， 3， 6， 12 and 24 hours post burn(PBH).The cardiac troponin T (cTnT) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) contents in plasma were measured by enzyme linked immunosorbent assay method (ELISA) and radioimmuno assay (RIA) respectively， RT-PCR and immunohistochemistry were applied to monitor the gene expression of GRP94. Resultsthe content of cTnT in plasma was significantly increased 3 hours post burn(P<0.01)， the gene expression of GRP94 and caspase-3 activity 3 hours post burn reached the peak after 12 h， while the GRP94 expression in Liqustazine treatment group was dramatically decreased.ConclusionSevere burn can induce GRP94 expression increase in rat cardiomyocytes， Liqustazine has notable inhibitory effects on GRP94 expression increase in the cardiomyocytes during the early stage of postburn.
       Key words： Burns; Liqustazine ; Glucose-regulated protein; Myocardial injury; Endoplasmic reticulum stress
       有研究表明内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)参与了脑缺血再灌注损伤，缺血(氧)、缺氧复氧可诱导心肌细胞内质网应激[1～3]，但严重烧伤早期是否会诱导心肌细胞发生内质网应激，以及内质网应激在严重烧伤后心肌损伤的作用特点少见报道[4]。本研究利用30%TBSAⅢ度烫伤动物模型，旨在观察严重烧伤大鼠心肌细胞内质网葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein 94， GRP94)的表达变化，探讨严重烧伤后心肌损伤与内质网应激反应的关系及川芎嗪(tetramethylpyraxine，TMP)对其的影响。
       1 材料和方法
       1.1 动物分组及烧伤模型制作[5]选健康成年Wistar大鼠(南昌大学实验动物中心提供，合格证号02196-02)，雌雄各半，体质量220～265 g，随机分为正常对照组、烧伤组和川芎嗪治疗组。烧伤组按常规方法[5]造成30%总体表面积Ⅲ度烫伤，即以2%巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，10%硫化钠脱毛，于92℃水浴18 s，造成30%TBSAⅢ度烫伤(经病理切片证实)。烧伤后按每公斤体质量1%烧伤面积4 ml等渗盐水腹腔注射，将总量一半分为2等份，于伤后即刻和伤后4 h注射，另一半则分为4等份，于伤后8，12，16及24 h注射，大鼠分笼喂养，自由进食、饮水，并于伤后1，3，6，12，24及48 h处死动物，检测有关指标。川芎嗪治疗组：大鼠烧伤后即刻腹腔注射川芎嗪注射液(20 mg/kg)，其余操作与烧伤组相同。正常对照组与烧伤组一样麻醉、脱毛，然后于37℃水浴18 s(假烫伤)，不补液，1 h后处死动物，检测有关指标。
       1.2 血浆中心肌肌钙蛋白T的检测应用酶联免疫法检测血浆中心肌肌钙蛋白T(cTnT)含量，用放射免疫法检测血浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量，按所购试剂盒说明书要求操作。
       1.3 心肌组织GRP94 mRNA表达分析按Trizol Reagent试剂盒说明书提取心肌组织总RNA。紫外分光光度计测定RNA含量，含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳显示出清晰的18S和28S RNA荧光条带。将RNA转录成cDNA，再行PCR扩增。目的基因GRP94引物序列的上游为5′-GAC GGG CAA GGA CAT CTC TAC AAA-3′;下游引物为5′-CTT CTT CTT CTG CCC CTG CGT CTG-3′，预计扩增的产物长度为362 bp。GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)的上游引物为5′-GCA AGT TCA ACG GCA CAG-3′;下游引物为5′-AGG TGG AAG AAT GGG AGT TGC T-3′，产物长度为723 bp。PCR反应条件为： 94℃ 3 min; 94℃ 40 s， 60℃ 40 s，72℃ 1 min，35个循环;结束前72℃延伸10 min。总反应体积25 μl。扩增片段通过凝胶成像系统分析。
       1.4 心肌组织GRP94蛋白表达检测取心肌连续切片5张，按S-P(streptavidin/peroxidase)法进行免疫组化及HRP显色，具体方法按试剂说明书进行。用CMIAS-8型图像分析系统检测心肌细胞GRP94蛋白阳性染色面积和平均吸光度值，二者乘积为积分吸光度。每张切片于阳性表达区选择5个无重叠视野，求出平均积分吸光度值，用积分吸光度大小表达蛋白水平的高低。
       1.5 心肌组织Caspase-3活性测定[6]取心肌组织0.3 g，用冷生理盐水洗2遍，在平皿上剪成碎块，置100目及200目尼龙网上，用眼科镊子夹持摩擦，以冷PBS液冲冼，收集细胞放入10 ml离心管中，2 000 g离心5 min，去上清。加PBS洗2次，加入细胞裂解液0.5 ml，充分振荡后，室温下作用30 min，15 000 g离心15 min;取上清100 μl转入到另一Eppendrof管中，加HEPES缓冲液1 ml，再加入AC-DEVD-AMC 10 μl(1 μg/μl)，37℃水浴60 min。于激发波长为385 nm，发射波长为465 nm处测定样品孵育前后荧光强度变化(△FA/h)。蛋白定量采用Lowry法。Caspase-3活性单位用DEVD-AMC nmol·h-1 mg蛋白表示。
       1.6 统计学处理所有实验结果数据均用±s表示，采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行处理，两组间均数比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性意义。
       2 结果
       2.1 血浆cTnT和TNF-α含量变化用酶联免疫法和放射免疫法分别观测了大鼠血浆中cTnT和TNF-α含量(见表1)。由表1可见，大鼠30%TBSAⅢ度烫伤后3 h血浆中cTnT含量即呈显著升高(P<0.01)，12 h达峰值，24 h仍显著高于对照组(P<0.01)，表明烫伤后有明显的大鼠心肌细胞损伤。血浆TNF-α水平在烫伤后1 h开始呈显著升高，12 h达峰值，24 h仍高于对照组(P<0.05)。与烧伤组比较川芎嗪治疗组各时相点血浆中cTnT、TNF-α水平均有显著性降低。表1 大鼠血浆cTnT、TNF-α含量
       2.2 心肌细胞GRP94 mRNA表达变化结果显示，在362 bp位置不仅有GRP 94的RT-PCR扩增片段(见图1～2)出现，而且烧伤组心肌细胞GRP 94 mRNA表达明显高于对照组;由图2(表2)可见，烧伤组大鼠心肌中GRP 94 mRNA表达于烧伤后3 h显著性升高，伤后12 h达峰值，伤后24 h还呈显著升高;川芎嗪治疗组GRP 94 mRNA的表达量较烧伤组有显著性降低。
       2.3 心肌细胞GRP94蛋白表达大鼠烧伤后3 h心肌中GRP94蛋白即开始升高，伤后12 h达峰值，24 h仍然高于正常对照组。川芎嗪治疗组大鼠心肌中各时相点的GRP94蛋白蛋白水平较烧伤组均有显著性降低(P<0.01);与烧伤组比较，在伤后12 h，川芎嗪治疗组GRP94蛋白水平下降了51.02%，说明川芎嗪对烧伤后大鼠心肌GRP94蛋白表达升高有较好的拮抗作用。见图3。
       2.4 大鼠烧伤后心肌细胞中Caspase-3活性变化从表3结果可见，大鼠心肌中Caspase-3活性在烧伤后3h开始升高，伤后12 h达高峰，24 h后仍显著高于对照组(0.35±0.06);川芎嗪治疗组烧伤后心肌Caspase-3活性较烧伤组均有显著性降低(P<0.05)。　　M为DNA marker 1-正常对照组 2-烧伤组 3-川芎嗪治疗组图1 烧伤后12h心肌组织GRP 94 RT-PCR结果M为 DNA marker 1.正常对照 2.伤后1h 3.伤后3h4.伤后6h 5.伤后12h 6.伤后24h图2 烧伤后各时相点心肌组织GRP94 RT-PCR结果表2 大鼠心肌细胞中GRP94 mRNA表达变化图3 大鼠心肌细胞GRP94蛋白表达变化表3 各组大鼠心肌细胞中Caspase-3 活性
       3 讨论
       内质网应激是细胞应激中的最初反应[7，8]，也是线粒体应激、核应激的最初共同通路。国内外研究[9]证实，严重烧伤早期存在心肌器质性损害，且早期心肌损伤也是造成心功能障碍的重要原因之一。本研究采用大鼠30%TBSAⅢ度烫伤(经病理切片证实)动物模型，观察严重烧伤后心肌细胞内质网应激蛋白GRP94和细胞促凋亡因子TNF-α的表达改变及其意义，探讨了内质网应激在严重烧伤后心肌损伤中的作用特点。结果显示，大鼠30%TBSAⅢ度烧伤后心肌GRP94表达于烧伤后3 h呈显著性升高，伤后12 h达峰值，伤后24 h还呈显著升高(见图1～3及表2);川芎嗪对烧伤后GRP94的表达增加有较好的抑制作用。GRP94和GRP78分子一样具有帮助未折叠蛋白正确折叠或促进错误折叠蛋白正确折叠的作用[8]。研究表明，内质网应激参与了脑缺血再灌注损伤，缺血(氧)、缺氧复氧可诱导心肌细胞内质网应激，GRP94表达上调是内质网应激的标志之一。本研究表明烧伤后心肌细胞存在内质网应激，并诱导心肌细胞凋亡，参与烧伤后心肌损伤。降低烧伤后心肌细胞内质网应激程度可能是防治严重烧伤后心肌损伤的重要途经。
       研究表明[9]，烧伤动物血浆TNF-α水平与反映心肌损伤敏感指标血浆心肌肌钙蛋白T(cTnT)的变化呈密切正相关，且血浆TNF-α水平与心肌组织TNF-α水平呈正相关，说明严重烧伤后无论血浆及心肌组织的TNF-α水平都是增高的，并发现缺血或内毒素可促使心肌细胞合成、释放TNF-α。本研究结果表明，川芎嗪对烧伤后动物血浆及心肌组织中TNF-α水平升高有很好的抑制作用。这可能是川芎嗪对烧伤后心肌损害有保护作用的机制之一。
       研究还表明，适当的ERS可诱导葡萄糖调节蛋白类(GRPs)、蛋白质折叠酶表达上调，增强细胞耐受应激刺激的能力;持续而又严重的内质网应激则会触发凋亡信号通路，诱导促凋亡因子TNF-α、caspase-12、CHOP/GADD153等表达和活化，在许多疾病[10]的发生发展中起重要作用。本研究结果显示，大鼠心肌Caspase-3活性在伤后3h开始升高，伤后12 h达高峰，48 h后仍显著高于对照组(0.35±0.06);川芎嗪治疗组对烧伤后心肌Caspase-3活性较烧伤组均有显著性降低(P<0.05)。表明烧伤后心肌细胞存在内质网应激，并可能介导心肌细胞凋亡，参与烧伤后心肌损伤;川芎嗪对烧伤后心肌细胞Caspase-3活性增加有较好的拮抗作用，减少烧伤后心肌细胞凋亡，这可能是川芎嗪对烧伤后心肌损害有保护作用的另一种机制[11]。随着内质网应激在心血管疾病中作用的深入研究，利用川芎嗪干预内质网应激有望成为今后治疗缺血(氧)/再灌注损伤等心血管疾病的新靶点。
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