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       【摘要】 
       目的探讨复宫宁治疗子宫内膜异位症(内异症)的作用机理。方法建立大鼠内异症动物模型，采用免疫组化SP法检测异位内膜雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的表达和阴道涂片法观察动情周期。结果复宫宁高、中、低剂量组能显著降低异位内膜ER、PR的表达并显著改善内异症大鼠的动情周期(P<0.05)。结论复宫宁可能通过抑制异位内膜细胞ER、PR的合成而发挥治疗作用，并具有整体调节作用。
       【关键词】  子宫内膜异位症; 复宫宁; 大鼠; 雌激素受体; 孕激素受体; 免疫组织化学法
       Abstract：ObjectiveTo explore the mechanism of Fugongning (FGN) in treatment of endometriosis.MethodsThe rat model of endometriosis was established, the expression of ER, PR in each group of ectopic endometrium was observed by immunohistochemical method. Estrum was observed by vagina smear method. ResultsAlldoses of FGN could obviously lower the expression of ER and PR in ectopic endometrium of endometriosis model rats and ameliorate their estrum(P<0.05) . ConclusionFGN can limit its growth of ectopic endometrium by lowering the expression of ER and PR in ectopic endometrium, and can adjust the rat whole.
       Key words：Endometriosis; Fugongning; Rats; Estrogen receptor; Progestin receptor; Immunohistochemistry method
       子宫内膜异位症(内异症，EMT)是激素依赖性疾病，异位内膜的生长和维持依赖于卵巢激素的刺激，并通过雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)发挥作用。目前无一种药物能够达到根治效果，丹那唑等药物副作用大，并发症多，复发率高。在我国，使用中药治疗内异症的疗效多不够理想。中药复宫宁制剂补肾祛瘀，前期的研究显示其具有降低血清雌激素水平，诱导细胞凋亡[1，2]和增强腹腔巨噬细胞吞噬功能、升高血液T细胞数量的作用[3]，从而促使内异症大鼠异位内膜萎缩而发挥治疗作用。本实验主要采用免疫组化SP法，以探讨复宫宁制剂对EMT模型大鼠异位子宫内膜组织中ER、PR表达的影响，进一步明确其治疗机理。现报道如下。
       1 材料与仪器
       1.1 动物健康雌性SD大鼠，85只，体质量180～220 g，由南昌大学实验动物中心提供，在江西中医学院病理实验室完成实验。
       1.2 药物复宫宁制剂: 由红花、蒲黄、延胡、三棱、莪术、巴戟天、菟丝子等中药经水提法制成，成人每天用量0.5 g/kg。Danazol胶囊：上海医药有限公司华联制药厂生产，国药准字:H31021681，产品批号:060301。
       1.3 试剂及仪器兔抗鼠ER、PR多克隆抗体，山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体及相应试剂盒为Santa Cruz Biotechnology INC公司进口分装，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Q550CW图像信息采集与分析系统等。
       1.4 造模实验动物适应性饲养14 d，每天同一时间阴道涂片，观察大鼠动情周期。在第3个动情期，采用自体子宫组织移植方法[4]建立EMT大鼠模型。以1%戊巴比妥钠麻醉，开腹找到子宫，切下左侧子宫角中段长约l cm，行端对端吻合术。将剥离的子宫内膜组织剪成0.5 cm×0.5 cm大小的内膜块，缝合在右侧子宫系膜，缝合切口。术后动物分笼单放，让其自然苏醒。常规饲养。
       2 方法
       2.1 分组及给药造模4周后抽取经剖腹证实造模成功的大鼠49只，随机分为5组，即：复宫宁高、中、低剂量组，丹那唑组，模型组。其中复宫宁高、中、低剂量组分别按3.0 ，1.5 ， 0.75 g/(kg·d)给药，丹那唑组以100 mg/(kg·d)给药(相当于成人1日剂量的10倍) ，模型组、空白组给予等容量生理盐水。每日灌胃1次，1 ml/次。持续给药4周。用药2周后，每日上午9时阴道涂片观察各组大鼠的动情周期。
       2.2 标本的采集与处理于末次用药24 h后，1%戊巴比妥钠麻醉后，剖腹，取下异位病灶，分离周围粘连组织。取右侧子宫中段(在位内膜)1 cm和异位内膜作为标本，置于10%的中性福尔马林溶液中待检。
       2.3 异位内膜ER、PR的染色及观察标本固定48 h后取出，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(片厚3～4 μm)、脱蜡、水化，采用免疫组化SP法染色。在400×视野下，选择异位内膜组织的被覆上皮含阳性物质(即核内棕黄色颗粒物质)最多的5个区域观察，计数100个细胞，组织学评分半定量[5]法确定ER、PR的表达情况。
       2.4 统计学方法所有数据均采用SPSS15.0统计软件进行处理，计量资料用单因素方差分析，组间比较用LSD检验。
       3 结果
       3.1 组织形态学变化光镜下异位内膜模型组形成封闭的环形结构，较在位内膜薄，内膜上皮为单层柱状、矮立方状或扁平状，大部分上皮细胞有分泌现象(可见核下空泡)，可见薄层间质和丰富的血管，有的见少量腺体或少量含铁血黄素及中性粒细胞浸润。各治疗组，内膜上皮呈低柱状、扁平状，单层松散排列，部分病灶内膜萎缩呈线状或者内膜脱落、消失。间质细胞明显减少，甚至缺如，周围血管少。仅个别病灶内见少量腺体。但也有个别病灶生长情况类似正常大鼠，子宫原有组织层次清楚，内膜生长较旺盛。
       3.2 复宫宁对异位内膜ER、PR表达的影响ER、PR主要表达于异位内膜组织上皮细胞和部分间质细胞的细胞核内，呈浅棕色到棕黄色，深浅不宜。结果见表1。表1 复宫宁对异位内膜ER、PR表达水平的影响
       3.3 复宫宁对动情周期的影响与正常大鼠比较，用药前模型大鼠的动情周期大部分紊乱，多表现为动情间期不规则延长。用药后，各治疗组大鼠的动情周期趋于规律的4～5 d。与模型组比，复宫宁各剂量组动情周期的改善率具有显著差异，而Danazol组几乎没有改善大鼠的动情周期。结果见表2。表2 复宫宁对大鼠动情周期的影响
       4 讨论
       EMT是一种激素依赖性疾病，雌、孕激素只有与内膜细胞上的相应受体(ER、PR)特异性结合，才能将雌、孕激素信息传递至细胞内的特定部位，从而影响细胞的代谢过程或对基因表达进行调控[6]。雌激素对激素受体有正向调节作用，还促使子宫内膜生长;孕激素对激素受体有降调作用，对子宫内膜生长有抑制作用。异位内膜组织激素受体表达状况直接影响本病的发生和发展。异位内膜分泌晚期仍具有高水平的ER、PR[7]，从而在分泌期保持旺盛的增殖活性。以血瘀立论的复宫宁制剂具有活血化瘀、散寒温经、补肾益精的功效，灌胃治疗内异症疗效好，毒副作用少。复宫宁制剂能够通过降低异位内膜ER、PR的表达而起到抑制异位内膜生长的作用。与内异康复栓[8]和理气胶囊[9]降低异位内膜细胞内ER、PR含量而治疗内异症的结果相似。对比丹那唑治疗子宫内膜异位症假绝经疗法的副作用，复宫宁制剂具有改善大鼠动情周期的作用，推测如与丹那唑合用，可以弥补单纯激素治疗的毒副作用。但陈琼华等[10]研究认为异位内膜ER、PR(尤其在增殖期)显著低于正常对照组，可能是导致异位内膜呈现不成熟生长而持续增长的原因。目前相当一部分内异症患者激素治疗失败可能与此有关。因此，仅仅通过降低异位内膜ER、PR的表达治疗EMT可能是不够的，复宫宁具有整体调节内异症大鼠动情周期的作用，在治疗上可能还存在复杂的作用机理，有待进一步研究。
       【参考文献】
         [1] 余跃飞，肖 纯，黄桂林，等.复宫宁诱导异位子宫内膜细胞凋亡的超微病理学研究[J].河北中医，2001，23(12)：951.
       
       [2] 余跃飞，肖 纯，温博贵，等.流式细胞术检测复宫宁诱导异位子宫内膜细胞凋亡的研究[J].中国中医基础医学，2002，8(11)：857.
       
       [3] 黄越燕，余廷华，黄桂林.复宫宁对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血T细胞的影响[J].浙江预防医学，2002，14(4)：10.
       
       [4] 肖 纯，黄桂林，彭泽华，等.大鼠实验性子宫内膜异位症模型复制[J].中国病理生理杂志，1995，11(3)：333.
       
       [5] Nisolle M, Casanas FR, Donnez J, et a1.Immunohistochemical analysis of proliferative activity and steroid receptor expression in peritoneal and ovarian endometriosis[J]. Fertility and sterility,1997,68(5):912.
       
       [6] 郎景和.子宫内膜异位症基础与临床研究，第1版[M].北京：中国协和医科大学出版社，2003：228.
       
       [7] Hao XP, Willis JE, Pretlow TG, et al. Loss of fragile histidine triad expression in colorectal carcinomas and premalignant lesions[J].Cancer Res,2000,60(1): 18.
       
       [8] 魏绍斌，曹亚芳，王 毅，等.内异康复栓对子宫内膜异位症大鼠异位和在位内膜雌、孕激素受体的影响[J].中国中医药信息杂志，2007，14(11)：25.
       
       [9] 王 燕.理气胶囊治疗子宫内膜异位症的实验研究[J].中国中医药信息杂志，2005，12(9)：29.
       
       [10] 陈琼华，曲军英，邱娜璇，等.VEGF、ER、PR在异位和在位子宫内膜中的表达[J].厦门大学学报(自然科学版)，2005，44(6)：870.