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       【摘要】 
       目的研究桑枝总黄酮的体外抗炎活性及其作用机制。方法IFN- γ和LPS 协同造成小鼠RAW264.7细胞炎症模型;Griess反应测定细胞上清液中NO产量;FRAP测定细胞总抗氧化能力;RT- PCR检测iNOS、COX-2、HO-1、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达;Western blot检测iNOS、p-ERK蛋白表达水平。结果桑枝总黄酮呈剂量依赖性抑制细胞上清液中NO含量并且无细胞毒性，提高细胞总抗氧化能力，下调iNOS、COX-2、 IL-1β、IL-6 mRNA和iNOS、p-ERK蛋白的表达，上调HO-1mRNA表达，但对TNF-α mRNA表达影响不大。结论桑枝总黄酮部分通过MAPK中的ERK信号转导通路抑制iNOS基因和蛋白的表达从而抑制NO的产量，提高细胞总抗氧化能力，同时下调COX-2、IL-1β、IL-6等炎症介质和上调抗炎介质HO-1的表达而发挥抗炎效果。
       【关键词】  炎症; 诱导型一氧化氮合酶; 细胞因子; 桑枝总黄酮; 作用机制
       Abstract：ObjectiveTo characterize anti-inflammative effect of total flavones from Morus alba L (TFM) on RAW 264.7 macrophages stimulated with interferon-γ (IFN-γ) / lipopolysaccharide (LPS). MethodsUsing IFN-γ plus LPS to stimulate RAW 264.7 macrophages as inflammatory cell model. Griess reaction was used for nitric oxide measurement, MTT assay were used for cell proliferation and viability, RT-PCR was used for assaying mRNA expression and Western blot was used for protein expression. ResultsTFM dose-dependently inhibited both NO production and iNOS expression in IFN-γ+LPS stimulated macrophages without inference on cell viability. The mRNA expression of inflammatory cytokines such as IL-1β and IL-6 was significantly inhibited by TFM treatment. TFM suppressed gene expression of COX-2 while increased HO-1 expression. The protein expression of iNOS and p-ERK was inhibited by TFM. ConclusionOur study suggests that TFM may exert protective effects against inflammation damage through the mechanism of inhibiting excessive NO, reducing pro-inflammatory mediators such as COX-2,IL-1β,IL-6， and increasing HO-1 expression and enhancing total antioxidant ability. The inhibition of iNOS and COX-2 expression by TFM may be partially mediated through extracellular regulated protein kinases (ERK/MAPK) pathway.
       Key words：Inflammation; Nitric oxide; iNOS; Cytokines; Total flavones of Morus alba L.; Mechanism
       桑枝(Ramulus Mori)是桑科桑属植物桑Morus alba L.的一年生干燥嫩枝。味微苦、性平，归肝经;具祛风湿、利关节、行水气之功效，适用于风寒湿痹、四肢拘挛、脚气浮肿之病症，临床多用于治疗关节肿痛、手足麻木、瘫痪等多种疾病[1]。桑枝醇提物和石油醚、醋酸乙酯及正丁醇提取物处理动物炎症模型有抗炎作用[2～4]。临床使用经验和现代药理研究均提示桑枝具有较好的抗炎效果，但桑枝抗炎药效的物质基础和作用机制尚未阐明。过量的NO对炎症的发生发展起着关键作用，对其诱导型合酶iNOS的调控有望成为治疗炎症的新策略[5]。致炎因子的刺激将活化巨噬细胞MAPK/ERK/NF-κB信号转导通路，细胞因子大量表达，诱导型合酶iNOS/COX-2经诱导产生大量NO和PGs,炎症介质推动级联瀑布反应，造成细胞损伤使炎症性疾病进一步恶化[6]。
       本文通过考察桑枝总黄酮(TFM)对RAW264.7 炎症细胞模型中NO产量的影响，检测总黄酮对炎症中诱导型合酶iNOS、COX-2、HO-1的影响，同时检测细胞因子及细胞总抗氧化能力的变化，检测iNOS、p-ERK蛋白水平的表达，来探讨其抗炎机制。
       1 材料与仪器
       1.1 药物与试剂桑枝Morus alba L.，购自上海养和堂中药饮片有限公司(批号：040707-8);D- 101 树脂购自天津南开大学化工厂;芦丁标准品，购自上海中药标准化研究中心;RAW264.7细胞，购自ATCC 公司;RPMI 1640、胎牛血清，购自Gibco 公司。二甲基亚砜(DMSO)、脂多糖(LPS)、TRIzol RNA 提取试剂、阳性对照药L- NIL、TPTZ、Griess反应试剂，均购自Sigma 公司;Bio- rad 蛋白测定试剂、PVDF膜、100bp DNA 梯度标准品购自Bio- rad 公司;鼠重组IFN- γ，购自chemicon公司。蛋白梯度标准品，购自Progema公司;iNOS、p-ERK、β-actin抗体和二抗购自Cell Signal 公司和Santa Cruz公司。ECL检测试剂购自GE公司。反转录聚合酶链式反应试剂盒购自北京博大泰克公司;引物由上海生物工程服务有限公司合成。其他试剂均为分析纯。
       1.2 仪器Rotavapor R- 220 旋转蒸发仪，瑞士Buchi 公司;MODULYOD- 230 冷冻干燥仪，美国Thermo公司;Spectra MAX190 酶标仪，美国MD 公司;D278532高速冷冻离心机，德国Hettich 公司;UV21700 紫外分光光度计，日本岛津公司;超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;PCR 扩增仪，德国Biometra 公司;GIS 凝胶图像分析系统，上海天能科技有限公司;单向电泳系统，美国Bio-rad公司;sMPIC2600C自动X线胶片洗片机，上海申贝。
       2 方法
       2.1 桑枝总黄酮制备桑枝饮片由上海市食品药品检验所检验为桑枝(报告书编号：20080324)。全草加热回流(70%乙醇，80℃)提取3次，滤液减压浓缩后挥干乙醇后，获得醇提浸膏。继石油醚脱脂后取适量浸膏分散在蒸馏水中，乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯提取物用D- 101大孔树脂柱吸附，以蒸馏水、稀乙醇预洗脱后，收集70%乙醇洗脱液，浓缩干燥获得总黄酮，以芦丁-硝酸铝比色法测定其纯度为61.38%。总黄酮冷冻真空干燥后-80℃保存，临用前配制。
       2.2 细胞培养RAW 264.7 细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，置于CO2 培养箱中，在37℃和5%CO2 条件下培养。
       2.3 检测指标
       2.3.1 Griess reaction 考察总黄酮干预后细胞上清液中亚硝酸盐含量的变化细胞悬液以每孔1×105/100 μl 接种于96 孔板，培养过夜。空白组采用含0.1%DMSO 的RMPI 1 640 培养细胞。模型组采用LPS(100 μg·L-1)和IFN- γ(1×104U·L-1)协同刺激细胞。总黄酮采用50，100，200 mg·L-1 3个剂量和预刺激6 h(-6 h)、总黄酮预处理6 h(+6 h)和同时加入(0 h)3个处理时间处理细胞。刺激维持24 h 后，吸取96 孔板中的培养液100 μl，加入等体积的Griess 反应试剂，室温反应10 min，酶标仪540 nm处读取光吸收值。计算总黄酮各剂量在不同处理时间对细胞上清液中亚硝酸盐抑制率。抑制率(%)=(模型组吸光值-各剂量干预组吸光值)/(模型组吸光值- 空白对照组吸光值)×100%。
       2.3.2 MTT法观察总黄酮对细胞活力的影响总黄酮各剂量处理组吸取96孔板中的培养液100 μl用于Griess 反应后，加入MTT(用PBS溶解为5 g·L-1)溶液10 μl，继续37℃培养4 h，加入50 μl三联剂(0.01 mol·L-1盐酸含10%SDS和0.04 mol·L-1异丙醇)过夜，用酶标仪读取570 nm和630 nm光吸收值，以空白对照为100%，计算总黄酮各剂量对细胞活力的影响。
       2.3.3 FRAP法考察总黄酮对细胞总抗氧化能力的影响FRAP溶液以0.3 mol/L醋酸盐缓冲盐(pH3.6)、10 mmol/L TPTZ(溶于40 mmol/L HCl)和2 mmol/L FeCl3以10∶1∶1(V/V)混合。取5 μl总黄酮干预后的蛋白样品加入245 μl FRAP溶液，并做空白对照静置10 min后，在酶标仪593 nm处测吸光度。
       2.3.4 RT- PCR 考察总黄酮对iNOS、COX-2、HO-1、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达的影响RAW264.7 细胞培养于30 mm细胞培养皿中，总黄酮100、200 mg·L-1剂量预处理1 h，用IFN- γ和LPS 继续处理4 h 后，加TIR试剂1 ml，按说明书提取RNA，所用RNA 的A260/A280 均在1.8～2.0 之间。按RT 试剂盒说明逆转录合成模板cDNA 后，按PCR 试剂盒说明应用PCR 仪进行聚合酶链反应，目的基因引物序列如下：：iNOS sense primer： 5’-gcctcatgccttgattcat-3’;iNOS antisense primer： 5’-gagggtgaattccaga-3’;IL-6：5"-tgaacaacg sense primor atgatgcacttgc-3",IL-6:5"-cgtagagaaca antisense primer agcataagtc-3",COX-2 sense primer 5’-gatacgtgttgacgtccaga-3’; COX-2 antisense primer 5’-gtctgtctagagtttcaccg-3’;IL-1βsense primer 5’-cctgtggccttgggcctcaa-3’; IL-1βantisense primer5’-ggtgctgatgtaccagttggg-3’; TNF-α sense primer 5’-ccctcacactcagatcatcttctcaa-3’, TNF-α antisense primer5’-tctaagtacttgggcaggttgacctc-3’;β-actin sense primer 5’-ccaaggccaaccgccgc-3’; β-actin antisense primer 5’-agggtacatggtgccgcc-3’。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后凝胶扫描仪观察拍照。
       2.3.5 Western blot 检测总黄酮对iNOS、p-ERK蛋白表达的影响RAW264.7 细胞培养于30 mm细胞培养皿中，总黄酮100，200 mg·L-1剂量预处理1 h后用IFN- γ和LPS 继续处理，用冰PBS 洗涤，加入蛋白酶抑制剂后收集细胞，超声破碎，离心(3 000×g，15 min，4℃)，取蛋白上清液进行蛋白含量测定。每孔加入25 μg 的蛋白上样，在7.5%和12%的SDS-PAGE凝胶中电泳，蛋白转移到PVDF 膜上，10%脱脂牛奶封闭，分别用一抗iNOS(1∶1 000)、p-ERK(1∶1 000) 、β- actin(1∶800)与膜4 ℃孵育过夜，PBST 溶液洗膜3×15 min，IgG- HRP 二抗(1∶2 000～1∶5 000)与膜孵育1 h，PBST 溶液洗膜3×15 min，膜控干后加ECL 试剂，X 线显影、定影。
       2.4 计学方法实验数据用±s表示，差异显著性检验采用t检验。
       3 结果
       3.1 桑枝总黄酮对细胞中NO 产量的影响IFN-γ和LPS协同诱导RAW264.7产生大量的NO，细胞上清中NO产物亚硝酸盐含量显著提高(P<0.01)。桑枝总黄酮呈剂量依赖性抑制细胞上清液中亚硝酸盐的积累(P<0.01)，而对静息细胞的NO产量没有影响，总黄酮和刺激物同时加入的处理时间抑制效果最好(表1)。表1 桑枝总黄酮对激活及静息细胞中NO产量的影响
       3.2 桑枝总黄酮对激活和静息细胞的活力影响桑枝总黄酮呈剂量依赖性提高刺激细胞的活力恢复到接近空白对照组，呈一定的细胞保护作用，在静息细胞中呈剂量依赖性提高细胞活力，促进细胞增殖。结果见表2。
       3.3 桑枝总黄酮对细胞总抗氧化能力的影响经LPS和IFN-γ诱导后，细胞的总抗氧能力从(43.01±11.57)，下降到(29.21±6.28)(P<0.05)，说明炎症过程中存在着氧化应激。桑枝总黄酮处理后，细胞总抗氧化能力较模型组有了不同程度的提高(P<0.05)。结果见表3。表2 桑枝总黄酮对激活和静息细胞活力的影响表3 桑枝总黄酮对细胞总抗氧化能力的影响
       3.4 桑枝总黄酮对诱导型合酶iNOS、COX-2、HO-1和炎性介质IL-1β、TNF-α、IL-6基因表达的影响对照组iNOS，COX-2，HO-1mRNA都为低表达。而经诱导物刺激后，同属于诱导型合酶的iNOS，COX-2，HO-1都高表达，上调量分别为各自对照组的71.93倍(P<0.01)，16.62倍(P<0.01)，4.19倍(P<0.05)。总黄酮2个剂量干预后iNOS表达较模型组下调了2.60%(P<0.05)，47.26%(P<0.01)，COX-2表达较模型组下调了0.52%(P<0.01)，7.22%(P<0.01)， 100 mg·L-1剂量对HO-1微弱下调，而200 mg·L-1剂量较模型组表达提高了8.2%(P<0.05)。
       经诱导物刺激后的模型组中IL-1β、TNF-α、IL-6都显著提高，各自为对照组的1129.17%(P<0.01)，59.91%(P<0.05)，12.99%(P<0.05)。200 mg·L-1剂量干预后IL-1β较模型组下调表达24.40%(P<0.01)，2个剂量干预后IL-6较模型组表达下调了23.78%(P<0.05)，26.99%(P<0.05)。总黄酮对TNF-α表达无影响(图1)。
       3.5 桑枝总黄酮对iNOS和p-ERK蛋白的影响经诱导物刺激后，iNOS蛋白高表达，是对照组的80.09%(P<0.01)。2个剂量下调iNOS较模型组下调3.28%和15.38%(P<0.05)。iNOS蛋白变化与iNOS mRNA变化一致。p-ERK在模型组中也表达提高，较对照组提高了70.25%(P<0.01)。p-ERK蛋白表达量总黄酮干预后较模型组分别下调5.93 %和 13.59%(P<0.01)。
       4 讨论
       NOS是NO生物合成的关键限速酶，用分子氧和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)使L-精氨酸转化为L-胍氨酸，同时产生NO。其家族分为2类3种，包括内皮型合酶(eNOS)、神经元型合酶(nNOS)和诱导型合酶(iNOS)，内皮型合酶和神经元型合酶统称为结构型合酶(cNOS)，其产生的生理浓度量的NO，参与神经信息传递、胃肠保护、免疫调节等生理功能，而在炎性因子或微生物、理化刺激下，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)将在短时间内合成过量的NO，NO与游离氧结合，生成强氧化剂过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)，导致氧化应激[7，8]。桑枝总黄酮呈剂量依赖性抑制NO稳定产物亚硝酸盐含量，对炎症损伤后的细胞有保护作用，并无显示细胞毒性，并能提高细胞总抗氧化能力。C-对照组 M-模型组 100，200分别为：桑枝总黄酮100 μg/ml，200 μg/ml剂量组图1 桑枝总黄酮对诱导型合酶及炎症介质基因水平的影响C-对照组 M-模型组 100，200分别为：桑枝总黄酮100 μg/ml，200 μg/ml剂量组图2 桑枝总黄酮对iNOS和p-ERK蛋白表达的影响
       丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导途径是细胞外信号引起细胞核内反应的通道之一,可参与细胞的凋亡、分化及生长增殖等多种过程，包括细胞外信号调节激酶(extra cellular regulated protein kinases, ERK)、JNK 、P38和ERK5共4条通路。炎症反应时，内毒素、促炎细胞因子及活性氧等能同时或顺次激活MAPK通路，其中细胞外调节蛋白激酶包括ERKl和ERK2，磷酸化激活的ERKl/2由胞质转位到核内，进而介导NF-κB、Ap-1、c-fos和c-Jun等的转录活化[9]。而NF-κB为调节iNOS、COX2等炎症介质的枢纽。在COX2和iNOS基因启动子上游的5’区域含NF-κB的结合位点[10]。iNOS和COX-2在对照组中均低表达，受LPS和IFN-γ诱导后高表达，以及经桑枝总黄酮处理后同时下调，验证了两者的共同表达和协同致炎的关系。HO/CO和NOS/NO具有密切的联系。NO的产生可诱导HO-1表达的上调，而 HO-1的上调是具有细胞保护，其产物胆红素、铁蛋白、CO起抗炎作用，且HO-1可通过ERK途径下调iNOS，而达到降低NO产量的效果[11]。桑枝总黄酮通过细胞内调节体系起作用，一方面下调iNOS和COX-2表达，一方面上调HO-1表达，产生抑制致炎系统和上调抗炎体系的双向调节作用，使机体内环境恢复平衡。IL-1β、TNF-α、IL-6在炎症急性期都高表达，桑枝总黄酮能下调IL-1β和IL-6的基因表达，但对TNF-α影响不大。
       综上可知，桑枝总黄酮是桑枝抗炎活性组分之一，其抗炎作用机制是部分通过抑制MAPK/ERK信号途径中p-ERK的蛋白表达，从而抑制iNOS、COX-2靶基因及蛋白的表达，进而控制NO产量和氧化应激，抑制致炎细胞因子表达的同时提高抗炎介质HO-1表达而发挥抗炎效果。
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