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       【摘要】 
       目的研究牡蛎肽肠内营养制剂对小鼠免疫功能的影响。方法以牡蛎肽为蛋白源，研制获得牡蛎肽肠内营养制剂，检测血液生化指标和脏器系数进行营养评定，采用小鼠脾淋巴细胞转化试验、碳粒廓清试验、乳酸脱氢酶测定法研究了其对免疫功能的影响。结果牡蛎肽肠内营养制剂可以维持小鼠正常生理生化功能，能明显增强小鼠的细胞免疫和NK细胞活性，低剂量组能增强小鼠的巨噬细胞吞噬功能。结论牡蛎肽肠内营养制剂对小鼠具有提高机体免疫的作用，可以作为肠内营养制剂应用于临床营养支持。
       【关键词】  牡蛎肽肠内营养制剂; 细胞免疫; 单核-巨噬细胞; NK细胞
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of oyster peptide-based intenal nutrition on immunological function in mice.MethodsOyster peptide-based internal nutrition was prepared from oyster peptide as protein resources. The nutritional status in mice was measured by blood parameters and organ coefficient. By lymphocyte transformation test, carbon particle clearance test and lactate dehydrogenase mensuration, the effect of oyster peptide-based internal nutrition on immunity was evaluated. ResultsThe preparation could maintain normal physiological functions of mice and enhance celluar immunity and NK cell activity. The low dose group could stimulate macrophage funnction. ConclusionOyster peptide-based nutrition can play a significant role in enhancing immunity of mice. The results indicate that the preparation can be used as a kind of interal nutrition in clinical nutrition support.
       Key words： Oyster Peptide-based Enteral Nutrition; Celluar Immunity; Monocyte-macrophages; NK Cell
       牡蛎味道鲜美，营养价值丰富，历来受世人推崇。运用现代食品工业发酵、酶解等技术手段得到的牡蛎提取物，含有大量的功能性短肽和多肽、氨基酸等营养成分，具有提高免疫、抗氧化[1]等多种生理功能，已被广泛地应用于功能食品、营养食品、保健医药等领域[2]。肠内营养制剂指应用于临床肠内营养支持的各种产品的统称，其原材料主要来源于陆地动植物提取物。肠内营养支持已经成为我国临床营养支持中重要的组成部分，大量的陆源肠内营养制剂已经上市，得到了市场的初步认可[3]。近年来禽流感、口蹄疫等禽畜类传染病的频发，使得陆源禽畜类传统食品原料存在着极大的安全隐患，加之陆源原料存在氨基酸价不高、功能成分有限等缺点，很难达到肠内营养制剂的要求。
       21世纪是海洋的世纪，开发海洋生物资源，向海洋索取食品、药品已经成为海洋生物资源可持续发展利用的重要内容[4]。海洋生物活性物质例如蛋白质、多糖、多肽、维生素、矿物质的研究已经取得了巨大进展[5]，但国内外对海洋生物活性物质在营养支持领域研究尚未见报道。因此，以海洋生物活性物质为肠内营养制剂营养源，研制新型临床肠内制剂，成为肠内营养支持领域一个重要的研究内容。
       肠内营养制剂多用于手术病人、危重病人、昏迷病人及不能经口进食病人、各种情况下的营养不良等病人的营养支持，机体免疫力低下是临床病人的普遍症状，容易导致各种术后并发症[6]。因此，肠内营养制剂对机体免疫功能的影响，是判断肠内营养制剂临床应用效果的重要评价指标。本文研究本实验室自行研制的牡蛎肽肠内营养制剂(Oyster Peptide-based Enteral Nutrition，以下简称OPEN)对小鼠免疫功能的影响。该制剂以牡蛎肽为蛋白源，玉米油和鱼油为脂肪源，麦芽糊精为主要碳水化合物来源，海水螺旋藻和果蔬粉为维生素和矿物质来源，混合研制得到。初步研究表明，牡蛎肽肠内营养制剂能提高机体免疫力，可以作为肠内营养制剂应用于临床营养支持，为新型肠内营养制剂的研制提供了重要的理论参考。
       1 材料
       牡蛎肽肠内营养制剂为本实验室自行研制提供。
       SPF级BALB/C小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCKK(粤)20080002。按每组10只随机分为5组。其中模型组，灌胃环磷酰胺20 mg/kg;阳性对照组，灌胃百普素(Pepti-2000);实验组分为低剂量组(0.04 g/g·bw)、中剂量组(0.08 g/g·bw)和高剂量组(0.16 g/g·bw)，灌胃OPEN。除空白组外，其余组动物均每天腹腔注射环磷酰胺20 mg/ml，同时灌胃给予营养液0.2 ml/10 g，连续给予15 d。
       2 方法
       2.1 血液生化指标检测和脏器系数各组给予营养液期间，每周测量体质量两次，每天进行日常观察1次。两周后脱颈处死，眼眶取血，计算脾脏、胸腺的脏器指数，测定总蛋白、白蛋白含量，进行营养评定。
       2.2 细胞免疫：小鼠脾淋巴细胞转化实验参照卫生部《保健食品检验与评价规范》(2003年版)的方法。
       2.3 单核-巨噬细胞功能：小鼠碳粒廓清实验 参照卫生部《保健食品检验与评价规范》(2003年版)的方法。
       2.4 NK细胞活性：乳酸脱氢酶测定法参照卫生部《保健食品检验与评价规范》(2003年版)的方法。
       3 结果与讨论
       3.1 血液生化指标和脏器系数结果OPEN制剂对免疫抑制小鼠的血液生化指标及脏器系数的影响结果见表1。与模型组相比，OPEN各剂量组总蛋白和白蛋白的含量均有所增加，其中中剂量组白蛋白和总蛋白具有显著性差异(P<0.05)，低剂量组总蛋白和高剂量组白蛋白增加具有显著性意义(P<0.05);OPEN各剂量组胸腺、脾脏和体重比值无显著性差异(P>0.05)。与阳性对照组比较，OPEN各剂量组的胸腺和脾脏体重比以及各项血液生化指标均没有显著性差异(P>0.05)。
       营养不良或因消耗性疾病等原因会导致机体蛋白质丢失，导致总蛋白、白蛋白等下降，因此，衡量食物对总蛋白和白蛋白的影响，是评价食物改善营养不良状况的重要指标。实验结果表明， OPEN可提高免疫抑制小鼠的白蛋白和总蛋白含量，对胸腺、脾脏和体重比值没有明显影响，OPEN可以维持小鼠的正常生理生化功能，改善机体营养不良的状况。表1 OPEN对小鼠血液生化指标和脏体比的影响
       3.2 细胞免疫结果用环磷酰胺造成免疫功能低下小鼠模型，通过灌胃OPEN观察其对免疫功能低下小鼠淋巴细胞增殖反应的影响。当T细胞受ConA刺激后母细胞发生转换，活细胞尤其是增殖的细胞通过线粒体水解酶将MTT分解为蓝紫色结晶而显色。光密度值能反映T细胞的增殖情况，体现了T淋巴细胞转化为T淋巴母细胞的能力。
       小鼠脾淋细胞在ConA刺激下的增殖百分率见图1。由结果可知，与模型组比较，各剂量组的脾淋巴细胞增殖率均有所增加，其中低、高剂量组脾淋巴细胞增殖率明显增高(P<0.05)，说明OPEN能对抗环磷酰胺所致的免疫低下小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的下降。表明OPEN能有效促进T淋巴细胞转化为T淋巴母细胞的作用，能明显增强机体的细胞免疫活性，改善机体免疫机能受抑状态，增强机体的特异性免疫功能。
       3.3 单核-巨噬细胞结果通过小鼠碳粒廓清实验，当碳颗粒进入血液后，血液中的吞噬细胞-单核细胞即吞噬异物颗粒。在一定范围内，吞噬速率与血中碳颗粒浓度成正比，而与已吞噬的碳颗粒量成反比。吞噬指数是反映了巨噬细胞的吞噬能力，体现了其非特异性免疫能力的强弱。由图2结果可知，与模型组比较，各剂量组的吞噬指数均有所提高，其中低剂量组吞噬指数有明显的增高(P<0.05)，中剂量组和高剂量组有增高的趋势，但无显著性差异(P>0.05)，效果不如低剂量组。说明OPEN低剂量组能增强小鼠巨噬颗粒异物的能力。由此推断，OPEN可能具有促进单核-巨噬细胞吞噬功能的作用，增强机体的非特异性免疫功能。图1 OPEN对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响(%，±s)图2 OPEN对小鼠单核-巨噬细胞功能的影响(10-2，±s)
       3.4 NK细胞活性实验结果本实验通过乳酸脱氢酶法来测定免疫低下小鼠的NK细胞活性。活细胞的胞浆内含LDH，正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外，通过光密度值反应NK细胞的杀伤活性。结果见图3。由结果可知，与模型组比较，各剂量组NK细胞活性有所增加，其中低、中剂量组具有显著性意义(P<0.05)。由此可见，OPEN具有增强小鼠NK细胞活性的作用，可以增强小鼠的非特异性免疫能力。图3 OPEN对小鼠NK细胞活性的影响(%，±s)
       4 结论
       自20世纪70年代临床营养支持由黎介寿等引入我国以来，肠内营养支持逐渐被我国临床医学家所接受，成为“肠道有功能且能安全使用”时的首选。随着肠内营养研究的不断进展，术后早期肠内营养支持能减少并发症，增强免疫促进恢复，提高病人对综合治疗的耐受性已渐成共识[7，8]。临床观察显示消化道肿瘤术后早期应用百普素行肠内营养治疗，能改善营养状况及提高机体免疫功能[9]。目前，国内市场上主要的肠内营养制剂产品大部分依靠进口，价格昂贵，限制了肠内营养制剂在临床上的应用。同时，上市的肠内营养制剂产品主要营养物质来源于陆地动植物，资源丰富且具有多种生理活性的海洋生物原材料没有得到广泛的应用。 本文针对上述问题，研制获得牡蛎肽肠内营养制剂，观察其对免疫低下小鼠的免疫功能影响。结果表明，牡蛎肽肠内营养制剂可以维持小鼠的正常生理生化功能，改善机体营养不良状况。并能明显增强小鼠机体的细胞免疫活性和NK细胞的活性，改善机体免疫机能受抑状态，同时增强机体的特异性免疫和非特异性免疫功能。从而缓解临床病人表现出的营养不良和免疫力低下的主要症状，减少病人的并发症，促进机体康复。初步研究推断，牡蛎肽肠内营养制剂可以作为肠内营养制剂应用于临床营养支持。关于牡蛎肽肠内营养制剂对临床病人的应用效果，需要进一步开展人群试食实验加以验证。
       【参考文献】
         　[1] 雷丹青，周先果，张 辉，等.牡蛎酶解液的抗氧化活性研究[J].时珍国医国药，2008，19(11)：2674.
       
       [2] Mingyong Zeng, Wenxuan Cui, Yuanhui Zhao, et al.Antiviral active peptide from oyster[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2008,26(3):307.
       
       [3] 吴园涛，孙恢礼，李 君.海洋生物型肠内营养制剂的研究进展[J].肠外与肠内营养，14(5)：301.
       
       [4] Davis D, Gartside DF.Challenges for economic policy in sustainable management of marine natural resources[J].Ecological Economics,2001,69:289.
       
       [5] Michael A, Borowitzka.Microalgae as sources of pharmaceuticals and other biologically active compounds[J].Journal of Applied Phycology,1995,7(1):3.
       
       [6] Barbara E.Wildhaber, Hua Yang, Ariel U, et al.Lack of enteral nutrition-effects on the intestinal immune system[J].Journal of Surgical Research,2005,123(1):8.
       
       [7] Laura Harkness.The history of enteral nutrition therapy: from raw eggs and nasal tubes tu purified amino acids and early postoperative jejunal delivery[J].Journal of the American Dietetic Association,2002,102(3):399.
       
       [8] 黎介寿.肠内营养-外科临床营养支持的首选途径[J].肠外与肠内营养，2003，10(3)：129.
       
       [9] 陈艳鸿，区小卫，丘 磊.消化道肿瘤术后百普素早期肠内营养的应用[J].实用医学杂志，2005，21(6)：627.