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       【摘要】 
       目的建立同时检测银杏内酯B(原料药)中苯、 甲苯、 二甲苯、 苯乙烯、二乙烯苯(大孔树脂残留)及乙醇、 醋酸乙酯(有机溶剂残留)等7种有机残留物的方法。方法以甲醇为萃取溶剂，采用超声提取法对样品进行前处理，采用气相色谱-质谱联用法进行检测。结果上述7种有机残留物在 10 min内能较好分离，样品的加样回收率 (n= 6)为 100.6%～113.4%，相对标准偏差为 0.44%～3.56%，最低检测限为6.71×10-6～3.32×10-5μg。结论该方法具有灵敏、 准确、 快速等特点。
       【关键词】  银杏内酯B; 大孔树脂残留; 有机溶剂残留; 气相色谱-质谱联用法
       Abstract：ObjectiveTo develop a method for the simultaneous determination of macroporous resins (including benzene，toluene，xylene，styrene，diethylbenzene) and solvent residues (including ethanol and ethyl acetate) in ginkgolide B(bulk drug).MethodsThe organic residues were extracted from samples by ultrasonic extraction with methanol and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry.ResultsAll the 7 organic residues were separated well in 10 min. The recoveries for spiked standards (n= 6) were 100.6%～113.4%. The relative standard deviations were 0.44%～3.56% . The limits of detection were 6.71×10-6～3.32×10-5μg.ConclusionThis method is sensitive， accurate and quick.
       Key words： Ginkgolide B; Macroporous resins; Solvent residues; Gas chromatography - mass spectrometry(GC-MS)
       银杏内酯B(Ginkgolide B，GB)作为已知最强的天然特异性血小板活化因子(Platelet-activating factor，PAF)拮抗剂，对治疗脑卒中病具有显著的疗效[1～3]。合肥拓峰生物工程有限责任公司采用新的技术/工艺从银杏总内酯中获得的GB单体，并开发出国家注册分类1类中药新药-银杏内酯B注射剂及原料药，其起始原料为银杏叶提取物;而银杏叶提取物的制备工艺中使用了苯乙烯骨架型大孔吸附树脂[4]，以及制备GB单体中使用了乙醇和醋酸乙酯有机溶剂[5]，因而高纯GB单体(原料药)中可能会残留苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯，以及乙醇和醋酸乙酯溶剂，含量超标会严重影响患者的用药安全性[6]。建立一种简便、高效的测定GB原料药中大孔树脂和有机溶剂残留量的检测方法，并制订合理的限量标准具有重要意义。
       目前大孔树脂和有机溶剂残留量的检测方法多为气相色谱法[7，8]，操作繁琐且灵敏度差，不能实现大批量样品的快速检验以及各组分的单独定量[9]。本文建立一种同时检测7种残留有机物的GC-MS法，采用了溶液直接进样方式和外标法、全扫描法定性、选择离子检测法定量，简便、快速、灵敏度。
       1 仪器及试剂
       QP2010型气质联用仪(日本岛津公司)，配岛津AOC-20i自动进样器，色谱柱为HP-1701毛细管柱;高精密度分析天平(0.00001);超声波清洗器。甲醇(色谱级，美国TEDIA公司)，其他有机溶剂均为标准品。GB对照品(纯度99%，中国药品生物制品检定所)。
       2 方法
       2.1 GC-MS条件
       2.1.1 气相色谱条件HP-1701 (14%氰丙苯基、86%聚二甲基硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25μm)毛细管柱;气化室温度：200℃， 升温程序：初温30 ℃， 恒温1 min， 以5 ℃/min升至35 ℃， 保持2 min，再以25 ℃/min升到160 ℃，保持1 min;载气 He (99.999% )，流速1.0 ml/min，线速度控制载气流量;分流比30∶1; 质谱接口温度 200 ℃，进样体积1 μl。
       2.1.2 质谱条件离子源温度 230 ℃， 电离方式 EI ， 电子能量 70 eV， 溶剂切除1.5 min，全扫描范围31～180 u，选择离子监测m/z 46(乙醇)、m/z 88(醋酸乙酯)、m/z 78(苯)、m/z 92(甲苯)、m/z 106(二甲苯)、m/z 104(苯乙烯)和m/z 130(二乙烯苯)。
       2.2 对照品溶液的制备精密称取二乙烯苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、无水乙醇和醋酸乙酯各100 mg、苯10 mg分别至100 ml容量瓶中，甲醇定容至满刻度，摇匀;精密量取苯对照品储备液40 μl、其他对照品储备液400 μl至10 ml容量瓶中，甲醇定容至满刻度，得每毫升含苯0.4μg、其它对照品40μg的混合对照品溶液，备用。
       2.3 样品处理精密称取GB原料药100 mg至10 ml容量瓶中，甲醇定容，加盖超声溶解5 min得GB溶液。
       3 结果
       3.1 进样条件的影响因素
       3.1.1 色谱柱的选择毛细管柱具有分离能力强、灵敏度高、分析速度快、适合多组分分离等优点。根据待测的有机溶剂都是易挥发且极性沸点相差较大的特点，选择毛细管柱。一般中极性的色谱柱可以将这些溶剂分开，因此本文选择HP-1701 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。
       3.1.2 进样方式和测定法选择《中国药典》中规定的进样方式主要有顶空进样和溶液直接进样法，顶空进样前处理繁琐，设置参数较多，难以精确控制。选择溶液直接进样方式，进样体积1 μl，直观准确，对照品和供试品溶液制备方法相同，便于比较。鉴于一次性检测的溶剂种类较多且极性沸点相差较大，选择程序升温法和外标法定性定量。
       3.1.3 溶解介质的选择《中国药典》2005年版对残留溶剂测定法要求对照品和供试品都能溶于同一种溶剂。实验证明，GB在水中几乎不溶，在甲醇中略溶，在乙醇和醋酸乙酯中微溶，在氯仿中极微溶解。而待测的有机溶剂都溶于甲醇。本文选择色谱级甲醇(纯度≥99.9%)，极性较高，出峰时间早;分子结构简单，分子量小，不会产生太多离子碎片;基本不含杂质，不会对待测溶剂出峰产生干扰。
       3.2 方法学验证
       3.2.1 专属性考察在上述优化条件下，采用全扫描模式得到总离子流图(见图1)，分析质谱图或直接从谱库搜索定性7种有机溶剂，得到每种待测溶剂的保留时间和分子离子数。另取纯甲醇进样做空白对照，可以看出溶剂对待测溶剂出峰没有干扰。采用选择离子监测(SIM)m/z 46(乙醇)、m/z 88(醋酸乙酯)、m/z 78(苯)、m/z 92(甲苯)、m/z 106(二甲苯)、m/z 104(苯乙烯)和m/z 130(二乙烯苯)，可以看到7种有机溶剂分离度良好。1.乙醇 2.醋酸乙酯 3.苯 4.甲苯5.邻二甲苯 6.间二甲苯 7.对二甲苯8.苯乙烯 9.间二乙烯苯 10.对二乙烯苯图1 混合对照品溶液全扫描模式下的总离子流图
       3.2.2 线性、检测限和重复性考察在上述优化条件下， 取一定浓度的混合对照品溶液进行重复性实验，平行进样6次。按照出峰顺序保留时间相对标准偏差 (RSD%)分别为0.02，0.17，0.02，0.01，0.009，0.009，0.009， 0.009， 0.007， 0.008 ( n=6)，峰面积相对标准偏差(RSD%)分别为0.88，3.24，0.50，0.93，2.70，1.76，2.05( n= 6)。将混合对照品溶液依次往下稀释，依次进样可以得到，得到峰面积 (Y)对质量浓度X(mg·L -1)的线性回归方程。结果见表 1。表1 线性回归方程和检测限
       3.2.3 精密度和加样回收率考察精密称取30 mg的GB对照品，加入 3 ml混合对照品溶液适量 ， 进行精密度和加样回收实验。平行6次进行日内精密度分析 ， 按照出峰顺序峰面积 RSD%分别为1.32，4.27，1.48，1.80，1.79，1.59，1.48; 连续操作3d (1次/d)进行日间精密度分析 ， 按照出峰顺序峰面积RSD%分别为1.46，3.63，3.72，2.99，3.24，3.83，3.16。连续重复6次，GB对照品中各物质的平均加样回收率(%)分别为113.3，103.3，113.4，106.4，102.6，100.6，104.8，RSD%分别为2.13，3.74，0.44，0.57，0.51，1.32，3.56。
       3.3 GB样品的测定结果混合对照品溶液中各有机溶剂的保留时间见图1，乙醇、醋酸乙酯、苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、苯乙烯、间二乙烯苯和对二乙烯苯的保留时间依次为2.113，3.017，3.397，5.447，6.749，6.845，7.155 ，7.247，9.178，9.277 min。取3批GB样品适量分别配制成GB甲醇溶液，每个平行进样3次。结果见表2。表2 GB样品中残留溶剂的测定结果
       3 讨论
       本实验建立了一种能同时检测7种残留有机溶剂的GC-MS方法，其具有简便、快速、可靠等特点。根据测定结果，参考ICH规定和《中国药典》相关内容，暂定银杏内酯B(原料药)中苯的含量不得超过2 μg/g，其它待检测溶剂不得超过200 μg/g。
       【参考文献】
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