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       【摘要】 
       目的研究半枝莲水煎液对免疫性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1表达的影响。方法Wistar大鼠72只随机分为正常对照组、模型组和半枝莲水煎液低、中、高剂量治疗组及秋水仙碱对照组共6组;采用猪血清腹腔内注射构建肝纤维化大鼠模型,肝组织切片HE染色后,光镜下观察大鼠肝组织纤维化程度;免疫组化染色法(SABC型)观察肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1含量变化。结果半枝莲水煎液各治疗组与模型组相比肝纤维化程度显著减轻;半枝莲中、高剂量治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1水平又显著低于模型组(P<0.01)。结论半枝莲水煎液能够显著降低免疫性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1表达。
       【关键词】  免疫性肝纤维化; 半枝莲水煎液; Ⅰ、Ⅲ型胶原; TGF-β1 ; T IMP-1
       半枝莲为唇形科植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的全草，微苦，凉，通气道、水道，有清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛、利尿和抗癌等作用，用于治疗咽喉肿痛，肿瘤，阑尾炎，肝炎，肝硬化腹水，肺脓疡，吐血，衄血，血淋，肾炎水肿等[1];据《中华肿瘤治疗大成》载，半枝莲主治原发性肝癌等消化道肿瘤、肺癌及子宫颈癌等妇科肿瘤，在广西民间有用其治疗肝炎、肝纤维化的用药习惯。我们前期实验结果研究表明半枝莲提取物对四氯化碳所致大鼠肝损伤具有保护功能[2]，本实验在此基础上，采用腹腔注射猪血清复合法制备免疫性肝纤维化大鼠动物模型的方法，通过免疫组化的方法，观察该药对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原、转化生长因子-β1(TGF-β1)及基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响,进而阐明对大鼠肝纤维化治疗作用及机制，为开发廉价有效的治疗化学性肝损伤药物提供理论依据。
       1 材料
       1.1 动物健康清洁级Wistar雄性大鼠72只，体质量220～2 500 g。由广西医科大学实验动物中心提供,合格证号:桂医动第11006号。
       1.2 药品与试剂半枝莲原料，由南宁市医药公司提供，经广西中医学院药学院生药教研室刘寿养教授鉴定确认后，粉碎为粗末(Φ1～3 mm)备用。秋水仙碱(Colchicine)德国进口，上海医药公司分装，批号:1155-2002。TGF-β1型和TIMP-1型免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司， TGF-β1和TIMP-1单克隆抗体试剂编号分别为BA0290、BC01140(操作均按试剂盒说明书进行)。
       1.3 半枝莲水煎液制备①将原料粉碎为粗末后，浸泡12 h以上(水浸过药面2 cm)。②武火煮沸后改用文火煎30 min，冷却30 min后滤渣取汁。将滤渣如上法再煎煮2次取汁。③将3次药汁混合，用文火浓缩至500 ml，所制得半枝莲水煎剂，每毫升含生药1 g，置冰箱4℃备用，使用前按要求配成所需浓度。
       2 方法
       2.1 动物分组随机取2只作为正常对照组。剩余大鼠进行肝纤维化造模,于第4周末组及造模大鼠各随机处死2只证实肝纤维化形成后,将其余造模大鼠随机分为模型组、半枝莲水煎液低、中、高各剂量治疗组、秋水仙碱对照组共5个组，每组10只。
       2.2 造模方法本实验采用腹腔注射猪血清复制免疫性肝纤维化大鼠动物模型的造模方法，注射无菌猪血清0.3 ml/100 g体质量，2次/周，共8周。但有所改进:采用高脂低蛋白食物(用玉米面为饲料，加0.5%胆固醇，实验第1、2周加20%猪油)， 10%酒精为唯一饮料，为了防止肝脏自然修复对实验结果的影响，各组于用药开始后仍每周注射无菌猪血清0.3 ml/100 g体质量1次(正常对照组除外)。
       2.3 给药方法各组给药情况如下：4周后，正常对照组和模型组灌服同容积的生理盐水; 半枝莲低、中、高剂量各治疗组分别灌服半枝莲0.25，0.5，1 g/100 g体质量;秋水仙碱对照组: 灌服秋水仙碱10 μg/100 g体质量;以上各组灌胃液体量为1 ml/100 g体质量，1次/d，共8周，其浓度及等效剂量按体表面积折算。
       2.4 标本制备各组分别于用药治疗后8周，于8周末最后1次注射猪血清后禁食48 h后称重,使用颈椎脱臼法处死大鼠,剖取肝脏,置于4%聚甲醛固定液中待用。
       2.5 观测指标及测定方法
       2.5.1 常规肝组织病理学检查将各组石蜡包埋、切片均作常规HE染色，光镜下观察肝组织改变及胶原纤维的分布，同时采用王宝恩等[3]肝纤维化的分级法进行人工量化。
       2.5.2 免疫组织化学检查将取出的肝组织用4%多聚甲醛固定24 h，梯度脱水之后透明石蜡包埋。采用热修复抗原SABC染色程序，切片浸入0.01 mol/L构椽酸缓冲液，微波炉加热沸腾15 min热修复，冷却后0.01 mol/LPBS溶液洗涤3次，滴加二抗及血清封闭液，室温20 min，滴加稀释一抗，4℃冰箱保存过夜，滴加SABC试剂，DAB显色，蒸馏水清洗，苏木素轻度复染，梯度脱水、透明、封片，光镜观察。每次染色时用试剂公司提供的TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TTMP-1阳性片作阳性对照，PBS代替第一抗体作为阴性对照。免疫组化结果均使用专业图像分析软件测定平均光密度值，用背景的光密度值减去阳性部位的光密度值即为阳性部位的吸光度值。
       2.5.3 免疫组织化学染色Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1 及TIMP-1免疫组织化学染色，染色过程中设阴性对照，阴性对照以PBS代替一抗，DAB显色。
       2.5.4 统计学分析各组资料分析应用完全随机设计的单因素方差分析。统计结果采用SPSS11.0软件包处理。
       3 结果
       3.1 肝纤维化程度分级0级:无胶原纤维组织增生;Ⅰ级：汇管区有少量纤维组织增生，纤维组织短而细;Ⅱ级：汇管区有较多纤维组织增生;Ⅲ级：汇管区有大量纤维组织增生，呈窄带状，并向肝小叶周围伸展;Ⅳ级：汇管区有大量纤维组织增生，呈宽带状，伸展包绕或分割肝小叶，中央静脉有偏位现象。分级结果见表1。表1 各组肝组织纤维化分级结果只
       3.2 免疫组化染色观察
       3.3 Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化观察正常对照组:肝脏Ⅰ型胶原阳性染色少见于汇管区纤维和中央静脉壁管,Ⅲ型胶原及纤维主要存在于大血管周围;模型组:肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原表达显著增加,可见于众多视野,其着色较深,主要分布于纤维组织增生的汇管区,狄氏间隙有沉积。与对照组相比胶原沉积显著增加,肝细胞胞质疏松,肝窦纤维化或闭塞;秋水仙碱组:病变程度较模型组有所减轻，汇管区,狄氏间隙仅见少量沉积。半枝莲水煎液各治疗组:病变程度显著减轻,胶原较模型组明显减少,纤维条索变窄。见表2。
       3.4 TGF-β1免疫组化结果正常对照组：未见TGF-β1阳性染色。模型对照组：大量TGF-β1阳性染色见于纤维间隔中的炎症细胞周围，其中少数胞浆中呈阳性染色。秋水仙碱组： TGF-β1阳性染色程度较模型组有所减轻，纤维间隔中炎症细胞、间质细胞胞浆内阳性染色明显减弱，细胞周围的阳性染色亦有不同程度的减轻。半枝莲各剂量组：TGF-β1阳性染色程度较秋水仙碱组明显减轻，纤维间隔中的炎症细胞内有少量阳性染色，大剂量组的阳性染色稍弱于中剂量组。见表2。
       3.5 TIMP-1免疫组化染色观察正常大鼠肝组织内偶见个别间质细胞表达;模型组：大鼠肝组织在造模结束时TIMP-1主要在纤维间隔内、汇管区和窦周围隙的间质细胞内表达，TIMP-1染色阳性者明显加深,位于细胞胞质中,未见细胞核表达; 秋水仙碱组：病变程度有所减轻，TIMP-1染色阳性细胞较模型组有所减少;半枝莲各治疗组：病变程度显著减轻，TIMP-1染色阳性细胞较模型组明显减少。见表2。表2 各组大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1平均光密度值结果
       4 讨论
       细胞外基质(ECM)合成和降解的主要调控因子是基质金属蛋白酶(MMPs)和组织基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)。肝纤维化形成的主要原因在于肝损伤期间ECM的沉积和降解间的动态平衡被打破，TGF-β1能刺激HSC合成多种ECM同时又可抑制ECM的降解。此外，TGF-β1还通过抑制细胞外基质降解、抑制肝细胞再生、诱导肝细胞凋亡等途径调节着肝纤维化的进程[4]。因此,肝纤维化的发生、发展与TGF-β1的表达上调密切相关。TGF-β1的突出作用是促进胶原与基质的合成,同时抑制其降解[5]。还可增加纤维连接蛋白(FN)及蛋白多糖(PG)的合成,并促进FN和胶原在ECM中的沉积,还通过抑制胶原酶和蛋白酶的产生,以及促进组织抑制因子如金属蛋白酶(MMPs),α2-巨球蛋白等前纤维蛋白溶酶抑制物的分泌,减少胶原的降解[6]，本实验研究结果显示，半枝莲大、中剂量组大鼠肝组织中TGF-β1的含量较模型组明显减少(P<0.05),肝纤维化程度及胶原纤维、网状纤维增生程度也明显轻于模型组,说明半枝莲水煎液能减轻肝纤维化程度，可能抑制TGF-β1的表达,推测可能是通过抑制HSC的活化与增殖，减少胶原合成,促进ECM的降解而发挥作用。肝纤维化时TIMP-1大量表达，使MMPs活性减少,造成肝损伤后增生的ECM成分尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原降解减少,沉积增多,而通过抑制TIMP-1的表达,可有效抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的增生,从而延缓纤维化的发展。本实验结果显示用药组肝组织TIMP-1的阳性总面积减少，平均灰度值增加。提示半枝莲可能通过抑制TIMP-1表达是促进ECM降解,拮抗肝硬化。
       本研究大鼠肝纤维化模型组中，Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1在肝纤维组织增生的汇管区及纤维间隔中均有强阳性染色;而半枝莲各治疗组的肝纤维化程度明显低于模型组，且Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1免疫组化染色也弱于模型组，说明半枝莲能抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP-1合成。由此推测,半枝莲抗免疫性肝纤维化作用机制之一可能是抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成及下调TIMP-1的表达而实现的。
       【参考文献】
         　　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005:77.
       
       [2] 李中华，赵晓芳.半枝莲水煎液对肝纤维化大鼠间质胶原和TGF-β1的影响.[J]山东中医药杂志，2010，1(29):41.
       
       [3] 王宝恩，张定凤.现代肝脏病学[M].北京:科学出版社，2003:181.
       
       [4] 吕 品，程凤凤，陈惠华，等.TGF-β1与肝纤维化[J].科学技术与工程，2004，4(4):308.
       
       [5] 张 愚，屈文东，柳利民，等.TGF-β1在实验性肝硬化中的免疫组化研究[J].大理学院学报，2005，4(1): 49.
       
       [6] Derynck R，Zhang YE，Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-β1 family signaling.[J] Nature，2003，425(9):577.