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       【摘要】 
       目的研究复方仙草颗粒对IgA肾病(IgAN)肾小球硬化大鼠TGF-β/Smads信号通路的影响，探讨其抗肾纤维化的作用机制。方法采用切除一侧肾脏，反复尾静脉注射较大剂量葡萄球菌肠毒素B(SEB)的方法制作比较接近人类IgAN肾小球硬化病变发展过程的大鼠实验动物模型。将大鼠随机分为正常对照组、病理模型组、复方仙草颗粒治疗组和蒙诺治疗组，用肾小球硬化指数(GSI)评价药物对IgAN肾小球硬化大鼠肾组织病理的影响，应用免疫组化法对比分析各组肾组织TGF-β1、Smad2蛋白及Smad7蛋白表达的差异。结果与对照组相比，3组实验大鼠肾小球均明显硬化，与模型组相比，复方仙草颗粒组和蒙诺组硬化程度明显减轻，GSI具有统计学差异(P<0.01);免疫组化病理图片分析可见，复方仙草颗粒组和蒙诺组TGF-β1、Smad2蛋白表达较模型组均明显降低(P<0.05或<0.01)，而Smad7蛋白表达较模型明显升高(P<0.05或<0.01)，但复方仙草颗粒组和蒙诺组之间比较，无差异(P﹥0.05)。结论复方仙草颗粒可通过降低Smads2蛋白、上调Smad7蛋白的表达，从而抑制TGF-β1的过度表达，延缓IgAN大鼠肾小球硬化的持续进展，而这可能是其抗肾纤维化的重要作用机制之一。其在控制IgAN肾小球硬化的疗效与和蒙诺相近。
       【关键词】  复方仙草颗粒; IgA肾病; 肾纤维化; TGF-β/Smads
       IgA肾病(IgA Nephropathy，IgAN)是指肾组织免疫荧光检查有大量颗粒性IgA或以IgA为主的循环免疫复合物在肾小球系膜区沉积的一种原发性肾小球疾病。本病是我国最常见的原发性肾小球疾病，约占原发性肾小球肾炎的1/3。在IgA肾病确诊后5～25年内有20%～40%患者可发展为慢性肾功能衰竭[1]。在对原发IgAN尚无有效病因治疗方法的情况下，主动性肾纤维化仍继续发展，故在IgA肾病的发病过程中，如何采取有效措施控制肾纤维化的发展成为控制该病进展的不可缺少环节。
       1 材料
       1.1 动物选用SPF/VAF级Spragoe-Dawleg雌性大鼠44只，体质量(200±20)g，由广西中医学院动物中心提供。按照SPF级饲养，白由进食和饮水，适应性饲养1周。
       1.2 药品复方仙草颗粒(八仙草60 g，三七10 g，薏苡仁15 g，制大黄10 g，黄芪15 g，甘草6 g等组成，为颗粒免煎剂，由江苏天阴制药有限公司生产，批号：0705337)，蒙诺(福辛普利，每粒10 mg，由中美上海施贵宝制药有限公司生产，批号：H19980197)。
       1.3 试剂葡萄球菌肠毒素B(SEB)(中国人民解放军军事医学科学微生物研究所)，盐酸阿霉素(10 mg/瓶，浙江海正药业股份有限公司，批号040801)，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体、兔抗大鼠Smad2、Smad7多克隆抗体(美国santa cruz公司)， SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物公司)，DAB显色液(北京中杉金桥生物公司)。
       2 方法
       2.1 造模采用切除一侧肾脏，反复尾静脉注射较大剂量葡萄球菌肠毒素B(SEB)的方法制作比较接近人类IgAN肾小球硬化病变发展过程的大鼠实验动物模型[2]。模型组：实验0周时以戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，行左肾摘除术。常规消毒，背部切口1～1.5 cm，暴露左肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，结扎左肾门血管，切除左肾，缝合切口。分别于2，4，6周尾静脉注射SEB0.6 mg/kg。为了防止肾脏自然修复对实验结果的影响，于用药开始后仍每周尾静脉注射阿霉素(ARD)3 mg/kg(体质量)1次(A组除外)。实验周期为14周。
       2.2 动物分组及用药随机取12只作为正常对照组(A组)。剩余大鼠进行IgAN肾纤维化造模，于第6周末A组及造模大鼠各随机取2只，清洁代谢笼收集大鼠12h尿液，检测尿红细胞艾迪氏计数，处死迅速取出肾组织，液氮速冻，免疫荧光证实IgA肾病形成后做相关试验。造模成功后，将IgAN大鼠随机分为病理模型组(B组)、复方仙草颗粒治疗组(C组)、蒙诺治疗组(D组)共4组，每组10只。造模第7周开始各组分别予以灌胃给药，A、B组予生理盐水，C组予复方仙草颗粒溶液(按成人用量单位体重的20倍给药)，D组予蒙诺溶液(蒙诺去胶囊释成冲剂液，含药0.33 g/ml)，均按10 ml/kg体质量，1次/d灌胃。各组于用药治疗8周后，处死，迅速剖取肾脏，取右肾脏下极相同部位组织1块置入10%甲醛固定，作常规石蜡切片。实验造模过程中大鼠死亡2只，由于灌胃操作不慎大鼠死亡3只。
       2.3 指标检测及方法
       2.3.1 肾组织病理学检查肾组织标本经固定、脱水、透明、石蜡包埋，切片3 μm厚。PAS染色观察肾脏病理改变，用单盲法对肾小球硬化评分，参照Raij等[3]的半定量评估法评估肾小球硬化程度。对每张PAS染色的肾组织切片在光镜下随机检测20个肾小球，根据小球硬化所占肾小球的比例分为0～4个级别：0级表示肾小球无病变;1级表示25%面积硬化;2级表示26%～50%面积硬化;3级表示51%～75%面积硬化;4级表示76%～100%面积硬化。用肾小球硬化指数(Glomerulosclerosis Index，GSI)来评定肾小球硬化的程度。GSI=[(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/每张切片观察肾小球总数]×100%，式中N1代表1级损害肾小球个数，N2代表2级损害肾小球个数，N3代表3级损害肾小球个数，N4为4级损害肾小球个数。
       2.3.2 免疫组织化学检查采用SABC法检测肾组织中的TGF-β1、Smad2、Smad7的表达，肾组织标本经固定、脱水、透明、石蜡包埋，切片3 μm厚;滴加3%H2O2于切片上，切片放于湿盒内10 min以灭活内源性的过氧化物酶;PBS洗3次;高压锅抗原修复;滴加正常山羊血清封闭液，室温放置20 min，甩去多余液体，不洗;滴加一抗(TGF-β1、Smad2、Smad7稀释度均为1∶100)，4℃过夜，用PBS替代一抗作为阴性对照;PBS洗3次;滴加生物素化的二抗后37℃30min，PBS洗3次;滴加试剂SABC，37℃ 20min，PBS洗4次;DAB显色(镜下控制显色清晰度)5 min;苏木素复染、脱水、透明、封片。免疫组化半定量分析借助HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告分析系统，每张组织切片随机取10个肾小球，测试其光密度值，测定肾组织TGF-β1、Smad2、Smad7，计算吸光度值，吸光度值越大，表示表达量越多。计算标本的平均吸光度值，各组均数之间进行比较。
       2.4 统计学方法计量数据用±s表示，采用SPSS13.0统计软件处理数据，应用单因素方差分析进行多组间分析。如方差齐性时用t检验，方差不齐时可用t"检验。
       3 结果
       3.1 肾脏病理改变IgAN肾纤维化大鼠造模6周末，收集造模大鼠12h尿液可见明显肉眼血尿，尿红细胞艾迪氏计数明显高于对照组(P<0.01);免疫荧光见造模大鼠肾小球系膜区及毛细血管襻团块状、颗粒状IgA沉积为主，伴有IgG、C3沉积，而正常组大鼠肾小球系膜区无IgA、IgG、IgM、C3沉积。见图1。
       3.2 肾小球硬化情况肾组织切片经PAS染色可见，除对照组外的3组实验大鼠肾小球均呈局灶节段性硬化甚至全小球硬化，系膜细胞增殖，系膜基质增多，毛细血管襻皱缩，甚至塌陷或闭塞，球囊粘连明显。部分小管内见蛋白管型，其中以模型组最为显著;与对照组相比，3组实验大鼠肾小球均明显硬化，GSI有统计学意义(P<0.01);但与模型组相比，C组和D组硬化程度明显减轻，具有统计学差异(P<0.01)。见表1、图2。
       3.3 肾脏TGF-β1及Smad2、Smad7蛋白的表达免疫组化病理图片分析可见，对照组肾小球系膜细胞有微弱的TGF-β1表达，肾小管上皮细胞、间质细胞均未见表达，而在B、C、D三组的肾小球系膜细胞、肾小球囊上皮细胞均有较强表达，对比模型组(B组)，C、D两用药组的TGF-β1表达较少(P<0.01)，而C、D两组比较无差异性(P>0.05)，见图3，表2;对照组肾小球Smad2蛋白几乎无表达，而B、C、D组Smad2蛋白阳性率明显增加，与B组相比，C、D组Smad2蛋白阳性率相对较低(P<0.01)，C、D两组比较无差异性(P>0.05)，见图4，表2;各组Smad7蛋白在肾小球和皮质肾小管上皮细胞内均有表达，髓质肾小管有分布较少，尤其以对照组表达最多，明显高于其他3组(P<0.01)，与B组相比，C、D组Smad7蛋白表达较多(P<0.01)，C、D两组比较无差异性(P>0.05)。见图5，表2。图1 造模大鼠肾组织 图2 模型组大鼠肾小球免疫荧光切片 硬化程度(PAS,400×)图3 复方仙草颗粒治疗 图4 复方仙草颗粒治疗组大鼠组大鼠TGF-β1的表达(400×) Smad2蛋白的表达(400×) 图5 复方仙草颗粒治疗组大鼠Smad7蛋白的表达(400×)表1 各组大鼠肾小球硬化指数比较表2 用药后各组大鼠肾组织TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表达的比较(吸光度
       4 讨论
       虽然多种细胞因子，如白介素、结缔组织生长因子、肿瘤坏死因子等多种成分均有致纤维化作用，但无疑TGF-β是其中最主要的致纤维化因子，参与肾纤维化的各个重要环节，也是导致肾功能衰竭的主要病理机制。如何有效且安全地拮抗TGF-β是抗肾纤维化的重要研究方向。Smad蛋白为TGF-β受体后下游的信号转导因子，在整个发育过程和几乎所有的成熟组织中，Smads均有广泛表达。按其在传导通路中的不同作用可分为3类，即受体激活型Smad1，2，3，共同介质型Smad4，抑制型Smad6、7。参与TGF-β1/Smads这一信号传导途径的Smads家族蛋白主要有：Smad2，3，4，7[4]。Smad2、3为受体激活型蛋白，与TGF-β的I型受体(TRⅠ)结合形成受体复合物，在磷酸化后从受体复合物上释放出来，与胞浆内的Smad4结合形成低聚体复合物，转移到细胞核内激活核内细胞外基质成分如各型胶原等启动子的活性，从而细胞外基质合成增加[5]。活化的TRⅠ磷酸化R-Smads，启动了TGF-β信号转导通路，同时也激活了抑制因子Smad7。Smad7可抑制TRⅠ对Smad2和Smad3的磷酸化，增加泛素介导的TRⅠ自身的降解[6]，从而阻抗TGF-β的信号转导。
       阮永华等[7]的研究认为局灶节段硬化性IgA肾病、膜增生性IgA肾病、膜性肾病以及硬化性肾炎，肾小球中Smad2 mRNA和TGF-β1的蛋白表达均显著增高，与Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白(Fibronectin FN)在肾小球中的沉积呈正相关。另有研究发现，培养的人肾脏系膜细胞表达Smad2、3和Smad4的mRNA和蛋白，能被TGF-β1激活，通过Smad蛋白的信号传导，增加胶原基因的转录[8]。由此提示，Smad2作为Smad信号通路中起始的重要分子，可能参与了病变肾小球细胞外基质的过量沉积，在肾小球的硬化过程中起重要作用。
       在动物及人肾小球疾病中，肾小球Ⅰ型胶原的表达是肾小球硬化的特异病征。Chen等[9]对Smad7在肾小球系膜细胞(MC)Ⅰ型胶原产生中的作用进行了研究，结果发现TGF-β1可刺激小鼠MC Smad7高表达，并呈现剂量依赖效应。此外为了证实Smad7过度表达所产生的效应，又采用两种不同的方法检测TGF-β1对MC的影响：Ⅰ型胶原α2链(COL1A2)启动子片段的活性和亚精胺的吸收。用表达Smad7的质体转染MC可减少TGF-β1的促胶原积聚作用，这些结果均提示Smad7的活性是调节TGF-β的有效机制。
       近年来，湿热淤血作为慢性肾病的一个重要致病因素，其对肾病的发生、发展以及预后转归的影响越来越受到关注。湿热淤血伤肾是肾病的基本特点，且往往贯穿病程的始终。湿热淤血伤肾持续存在最终发展为肾纤维化而肾功能衰竭。复方仙草颗粒主要药物八仙草、三七等为广西特色中草药，其中君药八仙草入少阴经，能清湿热，散淤消肿、解毒利尿，三七有散淤止血，减少尿蛋白排泄，保护肾功能，薏苡仁健脾利水渗湿，制大黄活血祛淤泄浊，黄芪益气健脾利尿，配伍甘草可调和诸药。诸药合用，共奏清热利湿泄浊，散淤解毒消肿之功，祛邪不伤正，扶正不留邪，使邪祛正安。本研究表明随着IgAN大鼠病程的发展，造模大鼠可出现肾小球不同程度的硬化，通过各组间实验数据的分析，可发现经过复方仙草颗粒治疗的模型大鼠，肾小球硬化(GSI)明显降低，TGF-β1、Smad2蛋白表达收到抑制，而Smad7蛋白表达上调，该作用与蒙诺相近似。因此，可推测复方仙草颗粒可通过降低Smad2蛋白、上调Smad7蛋白的表达，从而抑制TGF-β1的过度表达，延缓IgAN大鼠肾小球硬化的持续进展，而这可能是其抗肾纤维化的重要作用机制之一。其在控制IgAN肾小球硬化方面具有和蒙诺相似的疗效。
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