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       【摘要】 
       目的研究比较3种五环三萜化合物齐墩果酸(OA)、乌苏酸(UA)、积雪草酸(AA)的护肝及抗氧化作用。方法建立小鼠D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)肝损伤模型，检测OA、UA、AA对损伤小鼠血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性以及肝组织脂质过氧化的影响;运用体外自由基清除试验，测定3种化合物对超氧阴离子和羟自由基的清除作用。结果100 mg·kg-1 OA、UA、AA均能有效抑制D-GalN/LPS引起的小鼠血清AST及ALT活性的显著上升;明显减少肝组织脂质过氧化产物MDA的生成;一定浓度3种化合物能有效清除超氧阴离子和羟自由基，且3个化合物清除自由基能力存在显著差异。结论3种五环三萜化合物OA、UA、AA均具有显著护肝和抗氧化活性，且AA、UA的护肝作用优于OA，其机理可能与其具有更强的清除自由基能力有关。
       【关键词】  齐墩果酸; 乌苏酸; 积雪草酸; D-氨基半乳糖/脂多糖; 抗氧化作用
       Abstract：ObjectiveTo compare the hepatoprotective and anti-oxidative effects of three pentacyclic triterpenoids, oleanolic acid(OA), ursolic acid(UA) and asiatic acid(AA). MethodsD-GalN/LPS-induced liver injury model was used to evaluate the effects of OA, UA and AA on the activities of serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and the level of liver lipid peroxidation in mice. Scavenging activity on superoxide anion and hydroxyl radicals of three compounds were investigated to determine their anti-oxidative effects.ResultsPretreatment with 100 mg·kg-1 OA, UA and AA, dovusly reversed the increase of serum AST and ALT activities and the level of liver lipid peroxidation induced by D-GalN/LPS in mice. OA, UA and AA, at concentrations ranging from 50 to 450 mol·L-1, showed dose-dependent superoxide anion and hydroxyl radical scavenging activity. In addition, it was also found that there were differences among three compounds in scavenging activity on free radicals, anti-oxidative and hepatoprotective effects. Conclusion Three pentacyclic triterpenoids, OA, UA and AA, have significant hepatoprotective activity against D-GalN/LPS-induced liver injury in mice. Moreover, the hepatoprotection and anti-oxidation of UA and AA are stronger than that of OA and the mechanisms might be related to their more powerful scavenging activities on free radicals.
       Key words：Oleanolic acid (OA); Ursolic acid (UA); Asiatic acid (AA); D-Galactosamine; Lipopolysaccharide; Anti-oxidation
       五环三萜类化合物分布广泛，资源丰富，毒性较低，具有广泛的药理作用和重要的生物活性，尤其在抗炎、护肝、抗肿瘤以及机体免疫调节等方面已经显现出令人关注的药理特性。其中以齐墩果酸(OA)研究最为清楚，作为抗肝炎药物亦早已应用于临床。乌苏酸(UA)为OA的同分异构体，现代药理学研究发现，UA不仅具有OA相同的生物学作用，而且在防治肝炎、抗肿瘤等方面比OA的作用更强大[1，2]。积雪草酸(AA)为OA、UA的结构类似物，除具有刺激胶原合成、抗炎、增强认知、抗肿瘤[3]等药理作用外，我们近期的研究首次发现其具显著抗肝损伤作用[4]。
       本研究拟运用D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)小鼠急性肝损伤和体外自由基清除试验，比较OA、UA及AA的护肝及抗氧化作用，为更好地开发利用五环三萜化合物提供依据。
       1 材料与仪器
       1.1 动物ICR小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自南京医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2002-0031。
       1.2 试剂齐墩果酸，中国药品生物制品研究所产品;乌苏酸、积雪草酸，Sigma-Aldrich公司产品;联苯双酯(DDB)，北京协和制药厂产品。D-氨基半乳糖、脂多糖、黄嘌呤、四唑氮蓝、细胞色素C、黄嘌呤氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)，Sigma公司产品。天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、丙二醛(MDA)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所产品。其余试剂均为国产分析纯。
       1.3 仪器Hitachi 7600-020全自动生化分析仪，日立公司产品;7520分光光度计，上海分析仪器厂产品; Biofuge Primo R 冷冻离心机，Kendro 公司产品;电热恒温水浴锅，北京市医疗设备厂产品。
       2 方法
       2.1 D-GalN/LPS急性肝损伤模型的建立小鼠分6组：正常组、D-GalN/LPS损伤组、OA、UA、AA组和阳性对照组。正常组和损伤组小鼠以0.2 ml·(10 g)-1体质量生理盐水连续灌胃5 d，OA、UA、AA组以及阳性对照组分别以100 mg·kg-1 3种化合物及200 mg·kg-1DDB同样方式灌胃;第6天正常组小鼠按0.2 ml·(10 g)-1腹腔注射生理盐水，其余组小鼠腹腔注射600 mg·kg-1 D-GalN;1 h后，除正常组小鼠腹腔注射0.2 ml·(10 g)-1生理盐水外，其它各组腹腔注射LPS(10 g·kg-1)，同时小鼠给予禁食不禁水。LPS注射12 h后，取血，分离血清，待测血清ALT、AST活力。处死小鼠后，取部分肝组织，制备肝组织匀浆，待测脂质过氧化水平。
       2.2 酶活力的测定分离得到的各组小鼠血清，全自动生化分析仪测定血清ALT及AST活性。
       2.3 脂质过氧化水平测定制备的肝组织匀浆，妥巴比法测定脂质过氧化水平。
       2.4 超氧阴离子清除实验利用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧自由基发生系统测定化合物对超氧阴离子的清除率[5]。实验分为11组：对照组，OA 三个剂量组(50，150，450 mol·L-1)，UA的三个剂量组(50，150，450 mol·L-1)，AA 三个剂量组(50，150，450 mol·L-1 )，阳性对照组。在3 ml的10 mmol·L-1 KH2PO4-KOH缓冲液 (pH 7.4)中加入相应浓度3种化合物、100 mol·L-1黄嘌呤及0.02 U·ml-1黄嘌呤氧化酶，加入100 mol·L-1四唑氮蓝，于25℃条件下孵育5 min，于550 nm处测定吸光值，以100 mol·L-1 SOD作为阳性对照。超氧阴离子清除率计算公式：(△AControl-△ADrug) /△AControl×100 %，△A=A0 min-A5 min。
       2.5 羟自由基清除试验利用CuSO4/细胞色素C自由基发生系统检测化合物对羟自由基的清除率[6]。实验分组同“2.4”项。在3 ml的0.15 mmol·L-1磷酸缓冲液(含100 mol·L-1 维生素C、100 mol·L-1 CuSO4及100 mol·L-1 细胞色素C，pH 7.4)中加入相应浓度3种化合物，反应体系于25 ℃中孵育90 min，于550 nm处测定吸光值，以60 mol·L-1 维生素E作为阳性对照。羟自由基清除率计算公式：(△AControl-△ADrug) /△AControl100 %，△A=A0 min-A90 min。
       2.6 统计方法进行单因素方差分析(one way analysis of variance, one way ANOVA)，各处理组的组间差异采用SNK-q(Student Newman Keuls-q)检验进行比较。
       3 结果
       3.1 对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤酶活力及肝组织脂质过氧化水平的影响由表1可看出，D-GalN/LPS损伤小鼠血清ALT及AST活性急剧升高，而预先予100 mg·kg-1的3种化合物灌胃的小鼠血清ALT及AST活性均显著低于损伤组，OA、UA、AA对血清ALT活性升高的抑制率分别为71.6 %，88.4%和 100 %;对血清AST活性升高的抑制率分别68.3%，84.7%和95.6%。比较3种化合物的护肝作用，发现其降酶效果存在显著差异：AA对损伤小鼠血清ALT酶活的抑制作用强于UA，而UA强于OA(P<0.01); AA和UA对损伤小鼠血清AST酶活的抑制作用强于OA(P<0.01)。
       小鼠D-GalN/LPS损伤后，肝组织脂质过氧化水平升高为正常小鼠的2.9倍，表明产生了肝组织的氧化损伤。而与损伤小鼠相比，预先以3种不同化合物灌胃给药的小鼠肝组织MDA水平有不同程度下降，OA、UA、AA对损伤引起的肝组织脂质过氧化水平升高的抑制率分别为63.5 %，83.8 %和91.5 %，其中AA、UA抑制作用强于OA(P<0.01)。
       3.2 对超氧阴离子的清除作用对超氧阴离子的清除试验结果(表2)显示，3种化合物对超氧阴离子有明显的清除作用，并且随着浓度的增加，其清除作用随之加强。比较相同浓度不同化合物对超氧阴离子的清除作用发现，AA、UA的清除能力超过了相同浓度的OA，450 mol·L-1AA对超氧阴离子的清除率(55.5%)及UA(49.4 %)与同浓度OA(40.4%)相比均有显著差异(P<0.01)。表1 OA、UA、AA对小鼠酶活力及肝组织脂质过氧化的影响表2 OA、UA、AA对超氧阴离子的清除作用
       3.3 对羟自由基的清除作用由表3可知，150及450 μmol·L-1 3种化合物对羟自由基具有显著清除作用。比较其对羟自由基的清除能力发现，3种化合物对羟自由基清除能力有显著差异， OA，UA、AA(450 μmol·L-1)对羟自由基的清除率分别为41.8 %、50.9 %和63.9 %，清除能力由强到弱的顺序为AA>UA>OA(P<0.01)。表3 OA、UA、AA对羟自由基的清除作用
       4 讨论
       D-GalN/LPS肝损伤是筛选护肝药、研究药物作用原理最常用的肝损伤模型[7]。本研究运用D-GalN/LPS小鼠急性肝损伤试验研究比较3种五环三萜化合物OA、UA、AA的护肝作用，实验结果表明，3种化合物对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤酶活力升高均有显著抑制作用，且3种化合物降酶效果存在显著差异：降低血清ALT活性能力强弱的顺序为AA>UA>OA;降低血清AST活性能力强弱的顺序为AA，UA>OA;同时检测了肝组织脂质过氧化产物MDA的量，发现3种化合物均能显著减少MDA的生成，表明其均具有抗氧化作用，且其抗氧化能力大小顺序为AA，UA>OA，该结果提示，3种化合物护肝效果存在显著差别，且该差异可能与它们的抗氧化能力强弱不同有关。运用自由基清除试验，进一步比较3种化合物的体外抗氧化能力，发现，一定浓度3种化合物对自由基具有显著清除作用，且不同化合物的自由基清除率存在显著差异，其清除自由基能力强弱的顺序与在体抗氧化的顺序一致(AA，UA>OA)。该结果进一步证实，该类化合物护肝作用强弱与其抗氧化作用之间可能存在相关关系。
       OA护肝、解毒作用已得到肯定，其机制认为是多重的，由于化学结构存在活泼的双键、羟基、羧基官能团，如与毒物结合易发生化学反应，达到解毒目的;能对抗自由基，抑制脂质过氧化物，有膜稳定作用[8];增加肝细胞谷胱甘肽酶活力，直接抑制转氨酶活性，抑制P4502E1的表达和活性，并且使肝细胞DNA及蛋白质合成速率明显增高，有促进肝组织修复的作用。UA和OA分子组成完全相同，二者为同分异构体，在保肝、护肝机制可能与OA有相似之处，并且其特色可能重在对抗自由基、抑制脂质过氧化物[1,9]。而AA和OA分子结构非常类似，比OA多2个羟基，推测，羟基数目的增加是AA抗氧化能力增强的重要原因之一。分析三者结构的差异，可以认为分子构象的不同以及羟基数目的差别可能是该类化合物抗氧化和保护肝细胞能力强弱不同的重要原因。
       鉴于五环三萜类化合物的优势以及OA护肝、解毒等方面比较成熟的临床用途，而AA及UA在抗氧化和保护肝细胞方面均显著优于OA，AA及UA护肝、解毒等功效值得关注，有望开发成为功能强大的护肝新药。
       【参考文献】
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