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       【摘要】 
       目的对鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物复叶耳蕨不同提取部位体外抗HIV-1整合酶活性进行研究。方法在体外无细胞系统内采用酶联免疫吸附测定HIV-1整和酶的半数抑制浓度(IC50)。结果复叶耳蕨醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物抑制HIV-1 整合酶的半数有效浓度IC50分别为 44.30，16.02μg/ml，水提取物抑制HIV-1整合酶的半数有效浓度IC50>100μg/ml。结论复叶耳蕨醋酸乙酯提取物与正丁醇提取物具有体外抑制HIV-1 整合酶活性。
       【关键词】  复叶耳蕨提取物; 抗HIV-I整合酶活性
       Abstract：ObjectiveTo evaluate the anti- HIV-1IN activities of the different extract parts from Arachniodes exilis Ching. MethodsHIV-1 IN reverse transcriptase, protease and integrase were detected by enzyme –linked inmunosorbent assay. ResultsIn the experiment of anti-HIV IN,the IC50 of the n-butanol extract acetic ether extract were 44.30, 16.02μg/ml, respectively. The IC50 of the aqueous extract was higher than 100 μg/ml.ConclusionThe n-butanol extract, acetic ether extract from Arachniodes exilis Ching have the inhibitory effect on HIV-1 IN activities.
       Key words：Arachniodes exilis; The different extracted parts; Anti-HIV-1
       复叶耳蕨Arachniodes exilis Ching为鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物,广泛分布于世界热带和亚热带湿润区域,以亚洲东部和东南部种类最为丰富,我国主要分布于长江流域以南地区及山东、河南等省,具有清热利湿、抗菌消炎、镇静作用,民间用于治疗急性黄疸性肝炎、关节炎、腰腿疼、痢疾、烫火伤等[1]。本课题组前期的初步研究发现：复叶耳蕨乙醇提取物在体外具有一定的抗HIV-1活性。本研究进一步探索复叶耳蕨不同提取部位体外抗 HIV-1 活性的作用。
       1 材料与方法
       1.1 样品制备复叶耳蕨材料采自九江市星子县，由九江学院药学系吴家忠副教授鉴定,采集后取样品根部洗净,切碎, 80℃烘干，粉碎,过70目筛,以80%乙醇提取3次，合并滤液，经旋转蒸发仪减压浓缩至稠膏状。采用液-液分配法，将复叶耳蕨根部粗提物用适量蒸馏水溶解，然后加石油醚萃取3次，对水层依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，将各步萃取组分浓缩，分别得稠浸膏，经国家新药筛选中心送至中国医学科学院医药生物技术研究所病毒药物实验室进行体外抗 HIV-1 整合酶活性筛选测试。
       1.2 体外抗 HIV-1 整合酶活性筛选测试采用酶联免疫吸附法测定：用合成的 30 个寡核苷酸作供体底物，用合成的 20 个寡核苷酸作为靶底物，96孔板包被供体底物加入纯化的HIV-1整合酶,进行酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ), 检测靶DNA链转移的产物, 以生物素标记的碱性磷酸酶系统显色, 酶标仪测定OD值。在该体系中加入样品可用于筛选该酶的抑制剂。 HIV-1 IN：由中国医学科学院医药生物技术研究所病毒药物实验室提取并保存。阳性对照药： S-y，上海有机所提供。供体底物和靶底物: 上海生工合成。样品处理：复叶耳蕨根部水提取部位样品临用前溶于水配成适当浓度，再作 5 倍稀释，4 个稀释度;醋酸乙酯、正丁醇提取部位分别溶于DMSO配成适当浓度，再作 5 倍稀释，4 个稀释度。
       2 结果
       样品稀释后加入供体底物包被 96 孔板中，并加入含有基因工程靶酶biotin-靶底物的反应 Buffer 中，在最佳反应条件下孵育，以生物素标记的碱性磷酸系统显色，测定 405nm 吸收值OD值，计算出各样品对HIV-1 整合酶活性的抑制程度，得出各样品的半数抑制浓度(IC50)。 结果见表1。表1 复叶耳蕨各部分提取物抗HIV-1整合酶活性
       3 讨论
       HIV-1 是人类最为严重的致死性疾病 ,因此寻找有效的抗 HIV-1 药物 ,彻底攻克恶疾,是世界医学界重要的研究课题。近年来,合成类化学药在临床治疗方面取得了显著的进展。但由于HIV-1 的高变异特性,接受药物治疗的大多数艾滋病患者对至少一种药物产生耐药,因而研究开发更多结构新颖的抗艾滋病药物仍具有重要的意义[2]。由于化学合成药具有较强的毒副作用使得其应用受到局限,从多种天然药物中提取高效、无毒的抗 HIV-1 药物为势之所趋。我国传统中药在治疗HIV-1方面具有作用机制独特、毒副作用小等特点,备受患者青睐[3]。复叶耳蕨是一种传统中药材，本课题组通过对其不同提取部位体外抑制 HIV-1 IN活性初筛试验，证明其正丁醇部位、醋酸乙酯提取部位具有体外抑制 HIV-1 IN活性，其中正丁醇部位强于醋酸乙酯提取部位。
       蛋白酶( PR) 、逆转录酶(RT)和整合酶( IN)是HIV-1生命周期中的3个重要的酶,抑制这3种酶的活性可抑制HIV-1的复制，目前抗HIV-1四类药物[4，5]中的三类是这些酶的抑制剂，即逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及整合酶抑制剂[6，7], 我们的研究证明复叶耳蕨提取物对整合酶有抑制作用，一定程度上表明它是一种具有抑制HIV-1病毒复制的中药，为证实该作用还需进一步在细胞水平及整体水平进行抗HIV-1作用的研究。 PR 、RT和IN都是由HIV-1基因组中的pol基因编码然后翻译成pol多聚蛋白，在病毒成熟过程中,蛋白酶将该多聚蛋白由5′端到3′端依次特定水解形成这3种酶，研究发现人类细胞中没有H IV 整合酶的类似物[8]; 无疑HIV-1整合酶是抗HIV-1重要、独特的靶点，近年来随着H IV-1 整合酶立体结构被测定出来,针对整合酶的抗病毒研究成为了治疗A IDS的热点，复叶耳蕨提取物体外具有抑制整合酶的活性，表明研究其抗HIV-1的作用对于开发抗HIV-1的新药具有重要的意义。
       【参考文献】
         　[1] 周道年, 阮金兰，蔡亚玲.复叶耳蕨地上部分黄酮类化合物[J].中国药学杂志,2008，43(16)：1218.
       
       [2] Clavel F, Hance AJ. H IV drug resistance[J]. N Engl JMed, 2004, 350: 1023.
       
       [3] 华允芬,吴江林,钱俊青.特种五谷虫脂肪酸的体外抗肿瘤、抗 HIV21 整合酶活性及组成分析[J].昆虫学 报, 2008,51 (2):137.
       
       [4] Reeves JD, Piefer AJ. Emerging drug targets for antiretroviral therapy[J]. Drugs, 2005, 65: 1747.
       
       [5] Traynor K. Integrase inhibitor gains FDA app roval[J].Am J Health Syst Pharm, 2007, 64: 2310.
       
       [6] Merschman SA, Vallano PT, Wenning LA, et al.Determination of the H IV integrase inhibitor, MK20518( raltegravir) , in human p lasma using 96well liquid-liquid extraction and HPLC2MS/MS[J]. J ChromatogrB Analyt Technol Biomed L ife Sci, 2007,857:15 .
       
       [7] Yang DG, He XC, Bai DL. Current status of HIV protease inhibitors[J]. Acta Pharm Sin,2005,40:389.
       
       [8] Ahn H C, Lee S Y, Kim J W, et al. Binding aspects of baicalein to H IV-1 integrase[J]. Mol Cells, 2001, 12(1):127.