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       【摘要】 
       目的研究青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(HELF)系 HFL-I细胞株体外生长的影响，为青蒿琥酯抗纤维化提供实验依据。方法采用CCK-8法检测青蒿琥酯对体外培养的HFL-I细胞的生长抑制作用，用流式细胞术测定细胞凋亡率; RT-PCR法测定Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达。结果青蒿琥酯呈浓度依赖性抑制HFL-I细胞增殖，HFL-I细胞经青蒿琥酯作用后凋亡率明显增加(P<0.01)，Bcl-2 mRNA的表达显著低于对照组，Bax mRNA的表达显著高于对照组。结论青蒿琥酯具有抗肺纤维化作用，可能机制为通过下调Bcl-2 mRNA和上调Bax mRNA表达抑制HFL-I细胞增殖，促进HFL-I细胞凋亡。
       【关键词】  青蒿琥酯; 人胚肺成纤维细胞; 增殖; 凋亡; Bax; Bcl-2
       肺纤维化是多种病因引起的一种慢性炎性间质性肺疾病，患者平均生存时间一般不超过3年，目前尚无有效治疗方法。近年研究发现，青蒿素类药物除可抗疟疾外，亦具有抗肿瘤、抗感染及抗纤维化等作用。2009-06～2009-11，我们观察了青蒿素衍生物青蒿琥酯对人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast，HELF)系 HFL-I细胞增殖、凋亡的影响及机制，旨在为临床治疗肺纤维化提供理论依据。
       1 材料
       HFL-I细胞株(中国科学院细胞库提供)，青蒿琥酯(分析纯，纯度>99% ，广西桂林南药公司产品，批号ZA080203)，CCK-8试剂，二甲基亚砜(DMSO)，碘化丙啶(PI)，D-MEM/F-12培养基，FBS，胰酶;RNA提取试剂Trizol，反转录试剂盒PrimeScript TMRT reagent Kit，PCR试剂盒Premix PrimeSTAR HS，引物由上海生物工程有限公司合成。
       2 方法
       2.1 HFL-I细胞培养取 HFL-I细胞株，用含10% FBS、1×105U/L青霉素及100 mg/L链霉素的D-MEM/F-12培养液培养，37℃、5% CO2培养箱培养，3 d换液1次，5～6d传代1次。取4代以上细胞用于下列实验。
       2.2 细胞增殖及细胞增殖抑制实验采用CCK-8法。取对数生长期 HFL-I细胞接种于96孔培养板中，每孔10 000个，12 h后分别加入浓度分别为2.5，5，10，20，40，80 mg/L的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液，每组设3个复孔，37℃、5%CO2饱和湿度下培养48 h，期间吸去培养液，PBS洗涤1次，加入含10% CCK-8溶液100 μl的无血清培养基，继续培养2 h后于450 nm处测定吸光度(A值)，并计算各组细胞抑制率。细胞抑制率(%)计算公式：[(1 - 实验组A值/ 对照组A值) ×100 %]。
       2.3 细胞凋亡形态学观察HFL-I细胞调整浓度为1×106/ml种于6 cm皿中，待细胞完全贴壁后，经10 mg/L青蒿琥酯作用48h，进行Hochst33258染色，于荧光纤维镜下观察并摄像。
       2.4 流式细胞数术检测细胞凋亡率　取对数生长期 HFL-I细胞，用含10% FBS的D-MEM/F-12培养液调整细胞浓度为1×106/ml，接种于25 cm2的培养瓶中，5% CO2、37℃培养箱中培养12 h至贴壁，用含0.5% FBS的D-MEM/F-12培养液培养24 h，使细胞周期同步化。加入浓度分别为1，10，100 mg/L的青蒿琥酯，对照组加入等体积培养液，每组设3个复孔，作用48 h后收集贴壁细胞，制成单细胞悬液，70%乙醇固定，4℃保存过夜，-20℃保存(有效期为1周)。检测前用PBS洗去固定液，加入20 μl RnaseA， 37℃孵育30 min，暗处加PI染液，冰浴30 min，染色后以300目筛网过滤。调整细胞浓度为1×105～6/ml后采用流式细胞仪，在波长488 nm下用Multicycle DNA分析软件行凋亡率测定，实验重复3次。
       2.5 RT-PCR检测Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达HFL-I细胞种于6孔板，细胞贴壁并长至80%丰度，换含2%血清培养基(D-MEM/F-12)培养12 h，后加入不同浓度的青蒿琥酯(1，10，100 mg/L)，设不加药物的阴性对照组，继续培养24 h后，用Trizol试剂提取高质量的mRNA。按照反转录试剂盒说明合成cDNA。PCR引物序列如下：人内参β-actin：上游引物5"-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3"，下游引物：5"-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3"，扩增长度300bp， Bax上游引物：5"-ATTGGAGATGAACTGGACAA-3"，下游引物：5"-CCACAAAGATGGTCACTGTC-3"，扩增长度454bp，Bcl-2上游引物：5"- CAGCTGCACCTGACGCCCTT-3"，下游5"-GCCTCCGTTATCCTGGATCC-3"，扩增长度198bp。
       2.6 统计学方法采用SPSS10.0软件进行统计学处理，计量数据用±s表示，行t检验，P≤0.05表示差异有统计学意义。
       3 结果
       3.1 青蒿琥酯对HFL-I细胞株增殖的抑制作用HFL-I细胞在给予2.5～160 mg/L的青蒿琥酯48 h后，生长受到显著抑制，并呈剂量依赖性(见图1)。测定青蒿琥酯对HFL-I细胞的IC50 为10 mg/L。图1 不同浓度青蒿琥酯对HFL-I细胞48 h增殖的影响
       3.2 青蒿琥酯对HFL-I细胞株凋亡的形态学观察经Hochst33258染色对照组中无凋亡细胞，青蒿琥酯组(10 mg/L)可见多个凋亡细胞，核碎裂且呈数个亮蓝色荧光颗粒。见图2。　A-对照组 B-青蒿虎酯10 mg/L图2 凋亡染色结果(Hochst33258，200×)
       3.3 青蒿琥酯对HFL-I细胞株凋亡率青蒿琥酯各浓度组(1，10，100 mg/L)的细胞凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(见表1)。表1不同浓度青蒿琥酯对体外培养的HFL-I细胞凋亡率的影响
       3.4 青蒿琥酯对HFL-I细胞株Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达的影响与对照组比较随着青蒿琥酯浓度的增大，Bcl-2 mRNA越来越弱，而Bax mRNA表达越来越强(见图3～4)。1.对照组 2.青蒿虎酯1 mg/L3.青蒿虎酯10 mg/L 4.青蒿虎酯100 mg/L图3 青蒿琥酯对 图4 青蒿琥酯对HFL-I细胞Bcl-2 mRNA HFL-I细胞Bax mRNA表达的影响 表达的影响
       4 讨论
       肺纤维化的发生涉及到诸多因素，而成纤维细胞增生或凋亡不足是肺纤维化形成机制中重要的环节，肺内ECM主要由成纤维细胞产生，正常时成纤维细胞处于静息状态，活化时大量增殖，分泌细胞因子，转变为肌成纤维细胞。故成纤维细胞的活化是肺纤维化形成的关键步骤及核心环节[1]。因此，抑制肺纤维细胞过度增生和促进其凋亡成为防治肺纤维化的一种有效手段。
       青蒿素是1972年我国科研人员首次从菊科植物黄花蒿中分离得到抗疟疾的有效单体，其衍生物包括二氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯，均含有过氧桥结构，属于新型倍半萜内酯化合物。除青蒿琥酯在碱性条件下可溶外，其他青蒿素衍生物均难溶于水[2]。目前，青蒿素类药物因毒性低、抗疟疾作用强已被WTO批准为在世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物。近年研究显示，青蒿素类药物尚有多种其他药理作用。徐光兰等[3]研究发现青蒿琥酯可降低肺纤维化大鼠TGF-β1、TNF-α的表达，明显减轻肺纤维化程度。本实验亦证实了青蒿琥酯可以抑制人胚肺成纤维细胞增殖、促进其凋亡。
       细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，它是机体在生长、发育和受到外来刺激时清除富余、衰老或受伤的细胞，以保持机体内环境平衡的一种自我调节机制[4]。细胞凋亡是一系列基因活动引起的级联反应的结果，在这些基因中，Bcl-2 家族与细胞凋亡关系最密切，有关研究较为深入[5，6]。 Bcl-2 和 Bax 是 Bcl-2家族成员是细胞凋亡过程中的一类调节因子，该基因家族包含两类功能相反的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因如Bcl-2基因，另一类为包含Bax等基因在内的促进细胞凋亡的基因，Bcl-2 和 Bax通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡，当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡;与Bcl-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能[7]。在体内， Bcl-2 与 Bax相互影响， 相互拮抗， 其作用并不直接表现为单独的 Bcl-2和 bax 对凋亡的影响， 而是由 Bcl-2/bax 来决定细胞是否发生凋亡[8，9]。
       本研究显示，实验组Bcl-2 mRNA表达均显著低于对照组，且有逐渐减弱的趋势。提示青蒿琥酯能抑制Bcl-2 mRNA在 HFL-I细胞中的表达，且呈剂量依赖性，而Bax mRNA刚好相反，此可能为其诱导细胞凋亡、对抗肺纤维化的的机制之一。
       【参考文献】
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