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       【摘要】 
       目的通过观察桦褐孔菌水提取物对糖尿病豚鼠的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等生化指标及对Ser/Thr激酶蛋白激酶B(PKB)、HMG CoA 还原酶(HMG CoA reductase)表达的影响，初步探讨桦褐孔菌影响糖尿病豚鼠脂类代谢的机理。方法选用成年雄性豚鼠48只分组，每组8只：正常组，桦褐孔菌小剂量组、中剂量组、大剂量组，阴性对照组及阳性对照组。链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制作豚鼠糖尿病模型，灌胃桦褐孔菌水提取物，治疗8周后，心脏取血测定TC、TG、LDL-C和LDL-C，取肝脏和骨骼肌，用Western blot测定HMG CoA 还原酶、PKB的表达。结果桦褐孔菌治疗TC、TG和LDL-C水平明显下降，HDL水平略有增高，HMG CoA 还原酶的表达降低，PKB的表达增高明显，并且表现为剂量梯度依赖。结论桦褐孔菌对糖尿病豚鼠TC、TG、LDL水平的降低具有明显的效果,这种结果可能和桦褐孔菌增强PKB表达和的降低HMG CoA 还原酶的表达，进而减少脂肪的分解和胆固醇的合成，一定程度上纠正脂类代谢紊乱相关。
       【关键词】  桦褐孔菌; 糖尿病豚鼠; 脂类代谢
       桦褐孔菌(Inonotus obliquus,Chaga)，主要分布于北纬45～50°的地区，在我国主要分布在黑龙江和吉林省长白山地区，民间广泛利用防治癌症等多种疑难杂症[1]。桦褐孔菌提取物具有很多生物活性，如增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒(主要是HIV)、抗氧化、抑制血小板聚集、抗炎、抗损伤、降血糖和血脂等作用。目前，国外对桦褐孔菌提取物治疗糖尿病已引起重视，但国内有关此项研究的报道较少。本实验通过测定糖尿病豚鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C等生化指标及对PKB、HMG CoA 还原酶表达，初步探讨桦褐孔菌对糖尿病豚鼠纠正脂类代谢紊乱的生物化学及分子生物学机制，为桦褐孔菌的临床应用提供理论依据。
       1 材料与仪器
       1.1 动物 Hartley雄性豚鼠80只，体质量500～600 g,由延边大学医学部实验动物科提供。
       1.2 用药桦褐孔菌水提取物，由延边圣林菌业有限公司提供。
       1.3 试剂STZ(美国Sigma公司)，蛋白质提取纯化试剂盒(Bioss p1250)，HMG CoA 还原酶、PKB单克隆抗体 (Santa Cruz,USA);其他试剂均应用国产优级纯试剂。
       1.4 仪器 全自动生化分析仪(日立7600)，电泳装置(Bio-rad)。
       2 方法
       2.1 制作糖尿病动物模型 实验动物适应性喂养1周后,禁食不禁水12 h,一次性腹腔注射STZ 80 mg/kg(临用前用pH 4.5的柠檬酸缓冲液溶解,配成浓度为1%混合液,30 min内注射完),第7天禁食不禁水12 h,用乙醚麻醉后取眦静脉血,离心后取血清测FBG,取FBG≥8.83 mmol/L者作为糖尿病成模标准[2]。
       2.2 实验分组及药物处理 取造模成功的糖尿病豚鼠48只(本实验造模成功54只)，按血糖和体质量随机分为阴性对照组(模型组)，桦褐孔菌小剂量组、中剂量组、大剂量组及阳性对照组(盐酸二甲双胍治疗组)，每组各8只，另选未造模的8只豚鼠为正常对照组，桦褐孔菌小剂量组、中剂量组、大剂量组分别灌胃桦褐孔菌提取物300，600，900 mg/kg。阳性对照组灌胃盐酸二甲双胍200 mg/kg，正常对照组和糖尿病模型组每天灌胃相同剂量的蒸馏水1次,连续8周。实验期间饲以标准饲料、自由饮水及新鲜蔬菜。
       2.3 实验观察及生化指标测量 实验8周后，各组禁食不禁水12h，麻醉后心脏取血测量生化指标 (TC、TG、LDL-C、HDL-C)。
       2.4 测定实验6周后，取豚鼠肝脏和大腿骨骼肌，利用蛋白质提取纯化试剂盒提取总蛋白质。提取的蛋白质进行10% SDS-PAGE电泳，每孔点样30 μl蛋白提取液(含30 μg总蛋白)，然后将电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上(4℃ 恒压100V，1.5h)。用牛奶封闭室温1 h后，用TBST清洗3次, 5 min/次。加入1∶1 000稀释的羊抗豚鼠HMG CoA 还原酶、PKB单克隆抗体室温培育1 h，再加入1∶200稀释的兔抗羊IgG二抗培育2 h。取出膜后，TBST充分冲洗3次, 15 min/次。压片后加入ECL显色液，置于UVP图像成像仪中观察并分析结果。条件设置为曝光1，2，4 min，CCD自动获取图像。以β-actin作为内参对照。
       2.5 统计分析 数据以±s，实验前后数据比较采用t检验，各组间进行单因素方差分析。实验数据处理均用SPSS16.0统计软件进行统计分析。
       3 结果
       3.1 实验组TG、TC的变化实验前后相比较，阳性对照组和桦褐孔菌提取物大剂量组的TG水平均显著减少(P<0.01)，桦褐孔菌提取物中剂量组的TG水平均明显减少(P<0.05)，阳性对照组和桦褐孔菌提取物大、中剂量组的TC水平均显著减少(P<0.01)。实验后，与阴性对照组比较，阳性对照组和桦褐孔菌提取物大剂量组的TG水平显著减少(P<0.01)，桦褐孔菌提取物中剂量组的TG水平均明显减少(P<0.05), 阳性对照组和桦褐孔菌提取物大、中剂量组的TC水平均显著减少(P<0.01),并表现为浓度梯度依赖性。结果见表1。表1 各实验组实验前后TG、TC的比较实验后与实验前比较，*P<0.05，**P<0.01;与阴性对照组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01;n=83.2 实验组LDL-C和HDL-C的变化实验前后相比较，阳性对照组和桦褐孔菌提取物大剂量组的LDL-C水平显著下降(P<0.01)，桦褐孔菌提取物中剂量组的LDL-C均明显下降(P<0.05), 阳性对照组和桦褐孔菌提取物大剂量组的HDL-C水平显著下降(P<0.01)，桦褐孔菌提取物中剂量组的HDL-C均明显下降(P<0.05)。实验后，与阴性对照组比较，阳性对照组和桦褐孔菌提取物大剂量组的LDL-C水平显著下降(P<0.01)，桦褐孔菌提取物中剂量组的LDL-C均明显下降(P<0.05)，阳性对照组和桦褐孔菌提取物大剂量组的HDL-C水平显著下降(P<0.01)，桦褐孔菌提取物中剂量组的HDL-C均明显下降(P<0.05)，并表现出浓度梯度依赖性;阳性对照组与桦褐孔菌提取物大、中剂量组的HDL-C水平比较无显著变化。结果见表2。表2 各实验组实验前后LDL-C和HDL-C的比较
       3.3 各实验组HMGCoA 还原酶和PKB表达的变化实验后，各实验组PKB和HMG CoA 还原酶表达情况见图1，桦褐孔菌低剂量组和阴性对照组与正常组比较PKB表达略低于正常组，阳性对照组和阴性对照组比较PKB表达显著增高，桦褐孔菌组的PKB表达呈浓度依赖性增加，桦褐孔菌高剂量组与阳性对照组比较，PKB表达显著增高。与此相反，桦褐孔菌组的HMG CoA 还原酶表达呈浓度依赖性减少，桦褐孔菌高剂量组的HMG CoA 还原酶表达均低于阴性对照组、正常组和阳性对照组表达，其中阴性对照组的HMG CoA 还原酶的表达量最多。图1 桦褐孔菌对HMGCoA 还原酶和PKB表达的影响
       4 讨论
       糖尿病是一种内分泌紊乱引起的代谢性疾病，由于胰岛素/胰高血糖素比值降低，脂肪分解加速，大量脂肪酸和甘油进入肝脏，过多的脂肪酸重新酯化成甘油三酯释放入血，形成高脂血症，酮血症等并发症。糖尿病病人由于体内生长素、肾上腺素、去甲肾上腺素等激素增多，使胆固醇合成的限速酶-HMG CoA还原酶增加，胆固醇合成增加，增加了动脉粥样硬化等心血管疾病的危险性。PKB是一种分子量约为60 kD的蛋白质，参与磷脂酰肌醇3(羟基)激酶(PI3K)等信号转导途径，在细胞增殖、细胞代谢、细胞凋亡等活动中起着重要作用[3]。PKB能够依赖PI3K介导胰岛素的传导通路，促进糖原的合成和GLUT4在细胞膜上的聚集，降低血糖。有实验证明糖尿病进程中骨骼肌内TG进行性增多，可减弱胰岛素信号通路中PKB的表达，加深糖尿病程度，进一步恶化脂类代谢紊乱[4]。为了探讨桦褐孔菌对糖尿病豚鼠脂类代谢的影响，实施了本次实验。本实验利用豚鼠制作STZ糖尿病模型，基于STZ具有能够直接破坏胰岛细胞导致胰岛功能衰竭，对其他组织毒性相对较少，实验动物存活率高的特点，并且，豚鼠和其他啮齿类动物比较，具有对药物非常敏感的特点。实验生化指标测定结果表明，桦褐孔菌中、高剂量组的TC、TG、LDL-C、HDL-C水平明显减少，并且具有浓度梯度依赖性，提示桦褐孔菌提取物对糖尿病豚鼠的脂类代谢紊乱有较好的治疗作用,这些内容和张香花等研究结果吻合[5]。Western blot结果表明，桦褐孔菌可降低HMG CoA还原酶表达，增强PKB表达。我们推测，PKB表达增强，一定程度上改善胰岛素通路的传导，对降低血糖具有促进作用，而血糖水平的改善，可以通过影响体内多种激素的代谢，改变HMG CoA还原酶的表达水平，减少胆固醇的合成，或通过其他代谢机制，减少脂肪细胞的分解，使糖尿病豚鼠的脂类代谢紊乱得到一定程度治疗。桦褐孔菌含有三萜类、类固醇、甾醇类、多糖类、木质素类、黑色素类、多酚类、鞘氨脂类似物、甘露醇、半单宁化合物、栓菌酸、生物碱、叶酸衍生物以及芳香物质等多种化学成分。桦褐孔菌提取物能够影响HMG CoA还原酶表达和PKB的表达，是否和这些单体成分有关，这些成分是否以单体或复合体的形式参与这些蛋白质表达的信号传导通路或转录调节过程，还有待于进行其他的相关实验加以确定。从以上分析可以推测，桦褐孔菌提取物对糖尿病豚鼠脂类代谢紊乱具有较好的治疗作用，其机制之一可能是通过对PKB表达的影响，介导胰岛素传导通路，改变体内相关激素水平，进而通过影响HMG CoA还原酶等脂类代谢相关酶类的表达，达到治疗糖尿病豚鼠脂类代谢紊乱的目的。
       【参考文献】
         　[1] 黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌-桦褐孔菌[J].中国食用菌,2002,21(4):7.
       
       [2] 杨丽萍,周文江,卫志明. 链脲佐菌素诱发豚鼠糖尿病模型的研制[J].上海实验动物科学，2001,21(2):111.
       
       [3] 王华祖,龚兴国.蛋白激酶B的研究进展[J].中国病理生理杂志,2003,19(11):1521.
       
       [4] 袁戈恒,王 薇, 郭晓蕙 ,等.自发性2型糖尿病骨骼肌内脂类代谢障碍对PKB的影响[J].山东医药，2005,45(35):25.
       
       [5] 张香花,孙东植,陈海月, 等.桦褐孔菌提取物对糖尿病大鼠生化指标的影响[J].中国食用菌,2008,27(5):41.